Uudised

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saavutamiseks soovitame kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Vähirakud on välja töötanud erinevaid mehhanisme, et saada üle raku stressist ja edasi areneda.Proteiini kinaas R (PKR) ja selle valgu aktivaator (PACT) on esmased reageerijad, mis jälgivad erinevaid stressisignaale, mis põhjustavad rakkude proliferatsiooni ja apoptoosi pärssimist.PACT-PKR raja reguleerimine vähirakkudes jääb siiski suuresti teadmata.Siin leidsime, et pikk mittekodeeriv RNA (lncRNA) aspartüül-tRNA süntetaasi antisenss RNA 1 (DARS-AS1) on otseselt seotud PACT-PKR raja pärssimisega ja soodustab vähirakkude proliferatsiooni.Kasutades CRISPRi 971 vähiga seotud lncRNA laiaulatuslikku funktsionaalset sõeluuringut, leidsime, et DARS-AS1 oli seotud märkimisväärselt suurenenud vähirakkude proliferatsiooniga.Seetõttu inhibeerib DARS-AS1 knockout rakkude proliferatsiooni ja soodustab vähirakkude apoptoosi erinevates vähirakuliinides in vitro ning vähendab oluliselt kasvaja kasvu in vivo .Mehaaniliselt seondub DARS-AS1 otse PACT aktiveerimisdomeeniga ja takistab PACT-PKR interaktsiooni, vähendades seeläbi PKR aktivatsiooni, eIF2α fosforüülimist ja inhibeerides apoptootilist rakusurma.Kliiniliselt ekspresseeritakse DARS-AS1 laialdaselt mitme vähi korral ja selle lncRNA üleekspressioon viitab halvale prognoosile.See uuring selgitab PACT-PKR raja vähispetsiifilist regulatsiooni DARS-AS1 lncRNA poolt ja annab veel ühe sihtmärgi vähi prognoosimiseks ja raviks.
Oskus stressiga kohaneda on vähirakkude ellujäämise ja proliferatsiooni oluline tunnus.Vähi kiire proliferatsioon ja metaboolsed tunnused saavutavad haripunkti karmides mikrokeskkondades – toitainete puuduses, hüpoksias ja madalas pH-s –, mis võivad vallandada rakusurma signaalirajad.Vähi korral täheldatakse sageli stressitundlike geenide, nagu p535, kuumašoki valkude 6, 7, KRAS8, 9 ja HIF-110, 11, 12, 13, düsregulatsiooni, blokeerides seeläbi apoptoosi ja soodustades ellujäämist.
Proteiini kinaas R (PKR) on eukarüootse initsiatsioonifaktori 2α (eIF2α) oluline stressisensor ja subühiku kinaas, translatsiooniregulaator, mis seob rakustressi rakusurmaga.PKR tuvastati algselt viirusevastase valguna võõra kaheahelalise RNA (dsRNA) tuvastamise teel.Aktiveerimisel fosforüülib PKR eIF2α, et pärssida viiruse ja raku valgu sünteesi 14, 15, 16.PACT (PKR aktivaatorvalk) on identifitseeritud kui esimene PKR aktivaatorvalk dsRNA puudumisel17,18,19,20,21,22,23.Otsese interaktsiooni kaudu PKR-ga muudab PACT mitmesugused pinged (seerumi nälgimine, peroksiidi või arseniidi töötlemine) üle PKR-ile ja allavoolu signaaliradadele.Lisaks eIF2α fosforüülimisele käivitab PACT-vahendatud PKR-i aktiveerimine mitmesuguseid stressireaktsiooniga seotud sündmusi, sealhulgas muutunud redoksolekut PI3K/Akt24 raja kaudu, tõhustatud DNA kahjustuste kontrollimist p5325,26 ja NF-κB27,28 kaudu, reguleerib transkriptsiooni, 29. Arvestades nende kriitilist rolli stressireaktsioonis, proliferatsioonis, apoptoosis ja muudes võtmetähtsusega rakuprotsessides, on PKR ja PACT paljutõotavad terapeutilised sihtmärgid paljude haiguste, eriti vähi jaoks .Vaatamata sellele pleiotroopsele funktsionaalsele ja bioloogilisele tähtsusele jääb PACT / PKR aktiivsuse reguleerimine vähirakkudes siiski tabamatuks.
LncRNA-d on transkriptid, mis on suuremad kui 200 nukleotiidi ja millel puudub valke kodeeriv potentsiaal.Kuna tipptasemel kogu genoomi järjestamise projektid on tuvastanud tuhandeid lncRNA-sid, on nende bioloogiliste funktsioonide selgitamiseks tehtud palju jõupingutusi.Üha suurem hulk uuringuid on näidanud, et lncRNA-d osalevad paljudes bioloogilistes protsessides37, sealhulgas X-kromosoomi inaktiveerimise reguleerimises38,39, trükkimises40, transkriptsioonis41,42, translatsioonis43 ja isegi vähi kasvus44,45,46,47.Need uuringud teatasid, et PACT / PKR rajas osalevad paljud lncRNA-d.Üks selline uuring näitas, et lncRNA ASPACT inhibeeris PACT transkriptsiooni ja suurendas PACT mRNA tuuma retentsiooni.Teised uuringud on näidanud, et lncRNA nc886 seondub PKR-ga ja inhibeerib selle fosforüülimist49,50.Siiani pole PACT-vahendatud PKR-i aktiveerimist reguleerivast lncRNA-st teatatud.
Aspartüül-tRNA süntetaasi antisenss-RNA 1 (DARS-AS1) on tuvastatud kui onkogeenne lncRNA51,52,53,54.On näidatud, et miP-194-5p53, miP-12952 ja miP-532-3p51 reguleerimise kaudu soodustab DARS-AS1 vastavalt selgerakulise neerurakulise kartsinoomi, kilpnäärmekartsinoomi ja mitteväikerakk-kopsukartsinoomi kasvu.Tong ja tema kolleegid leidsid ka, et DARS-AS1 soodustab müeloomi progresseerumist, säilitades valgu 39 (RBM39) RNA-d siduva motiivi stabiilsuse.Siiski ei ole läbi viidud uuringuid selle kohta, kas see lncRNA on seotud PACT-PKR aktiveerimise ja vähirakkude stressireaktsiooni reguleerimisega.
Siin teostasime CRISPRi süsteemi abil suuremahulise funktsiooni kadumise ekraani ja tegime kindlaks, et DARS-AS1 lncRNA soodustab mitut tüüpi vähirakkude proliferatsiooni.Lisaks oleme tuvastanud peamise mehhanismi: DARS-AS1 seondub otse PACT-ga, inhibeerib PACT-i ja PKR-i seondumist, takistab eIF2α, madalama PKR-i substraadi fosforüülimist ja lõpuks pärsib apoptootilist rakusurma.Kokkuvõtteks võib öelda, et meie töö näitab DARS-AS1 lncRNA-d kui PACT-PKR raja regulaatorit ja potentsiaalset vähiravi ja prognoosi sihtmärki.
Ulatuslikud genoomse profiili koostamise uuringud on tuvastanud sadu vähiga seotud lncRNA-sid.Nende funktsioon jääb aga suures osas teadmata56.Vähi progresseerumisega seotud paljutõotavate lncRNA kandidaatide tuvastamiseks teostasime CRISPRi süsteemi abil SW620 kolorektaalse vähi rakuliini proliferatsiooni vähenemise funktsiooni kadumise ekraani (joonis 1a).Käärsoolevähi rakuliinide SW480 ja SW620 ainulaadne omadus on see, et need pärinevad ühe patsiendi primaarsetest ja sekundaarsetest kasvajatest.See annab väärtusliku võrdluse kaugelearenenud käärsoolevähi progresseerumise geneetiliste muutuste uurimiseks.Seetõttu analüüsisime RNA järjestuse abil kolorektaalse vähi rakuliinide (SW480 ja SW620) transkriptoome ja kogusime avaldatud kirjandusest mõned potentsiaalsed funktsionaalsed lncRNA-d.Nende tulemuste põhjal koostasime koondsgRNA raamatukogu, mis sisaldas 7355 sgRNA oligot, mis olid suunatud 971 vähiga seotud lncRNA-le ja 500 sihtmärgita sgRNA oligot negatiivse kontrolli jaoks (täiendavad andmed 1).
Skriinimise skemaatiline esitus CRISPRi süsteemi abil.b sgRNA rikastamine pärast skriinimist.Horisontaalne punktiirjoon tähistab log2 (kordade muutus) = ±0,58.Vertikaalne punktiirjoon näitab p väärtust = 0,05.Mustad punktid tähistavad mittesihtmärk-sgRNA-d (tähistatud kui NC).Punased täpid on sgRNA-d, mis on suunatud DARS-AS1-le.Sinised punktid on sgRNA-d, mis on suunatud LINC00205-le, varem kirjeldatud onkogeensele lncRNA-le.kordne muutus = (normaliseeritud näit, 17. päev)/(normaliseeritud näit, päev 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown inhibeeris rakkude kasvu.Vearibad tähistavad ± kolme katse standardhälvet.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 kaheosaline Studenti t-test.d DARS-AS1 ekspressioon kasvajates (TCGA andmestik).em DARS-AS1 ekspressioon paaris normaalsetes ja kasvajaproovides patsientidelt, kellel on vastavalt BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ja COAD (TCGA andmestik).p-väärtused saadi paaris kahepoolse Studenti t-testi abil.
Pärast plasmiidi konstrueerimist ja lentiviiruse pakkimist transdutseerisime nelja sõltumatu infektsioonikatsega ülaltoodud raamatukoguga dCas9-SW620 kolorektaalse vähi rakuliini.Nende infektsioonide nakatumise kordsus (MOI) oli 0, 1–0, 3, mis näitab, et iga rakku saab transfekteerida ainult ühe sgRNA-ga.Pärast 18-päevast in vitro kultiveerimist sihtmärk-sgRNA-de rikastumisprofiil vähenes või suurenes pärast skriinimist, samas kui sihtmärgistamata kontrolloligonukleotiidide arv jäi sõelumise-eelse profiiliga võrreldes suhteliselt muutumatuks, mis näitab, et meie sihtmärgil on väga ekraanispetsiifiline profiil. raamatukogu.Riis.1b ja lisatabel 1). LINC00205, millest varem teatati, et see soodustab kopsuvähi ja maksavähi progresseerumist58, 59, 60, sõeluti välja (log2 (kordne muutus) < –0,58, p väärtus < 0,05), mis kinnitas selle sõeluuringu usaldusväärsust (joonis 1b). LINC00205, millest varem teatati, et see soodustab kopsuvähi ja maksavähi progresseerumist58, 59, 60, sõeluti välja (log2 (kordne muutus) < –0,58, p väärtus < 0,05), mis kinnitas selle sõeluuringu usaldusväärsust (joonis 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, mille kohta on varem teatatud, et see soodustab kopsuvähi ja maksavähi progresseerumist58, 59, 60, jäeti välja (log2 (kordne muutus) <-0,58, p-väärtus <0,05), mis kinnitab selle sõeluuringu tugevust (joonis 1b) . Linc00205 之前 被 可 促进 肺癌 肺癌 和 和 肝癌 进展 进展 进展 58,59,60 ， 被 选 （（（（Log2 （（））） <-0,58 ， P 值 <0,05） ， ， 证实 证实 （（（（（1b）） 1b）） （（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（1 Linc00205 之前 被 可 促进 肺癌 肺癌 和 和 肝癌 进展 进展 进展 58,59,60 ， 被 选 （（（（Log2 （（））） <-0,58 ， P 值 <0,05） ， ， 证实 证实 （（（（（1b）） 1b）） （（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（1 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, mille kohta varem teatati, et see soodustab kopsu- ja maksavähi progresseerumist58, 59, 60, jäeti välja (log2 (kordne muutus) <-0,58, p-väärtus <0,05), kinnitades selle sõeluuringu tugevust (joonis 1b).
Kõigi testitud lncRNA-de hulgas skriiniti ka DARS-AS1, kusjuures kolm sugulaslikku sgRNA oligonukleotiidi vähenesid oluliselt pärast 18-päevast kultiveerimist, mis viitab sellele, et selle lncRNA hävitamine vähendas vähi proliferatsiooni (joonis 1b).Seda tulemust toetas veelgi MTS analüüs kolorektaalse vähi rakkudes, mis näitas, et DARS-AS1 knockdowni rakkude kasvukiirus vähenes kontrollrakkudega võrreldes ainult poole võrra (joonis 1c) ja oli kooskõlas mitmete teiste vähitüüpide varasemate aruannetega.: selgerakuline neeruvähk, kilpnäärmevähk ja mitteväikerakk-kopsuvähk51,52,53,55.Selle funktsioon ja molekulaarsed mehhanismid kolorektaalse vähi korral on aga uurimata.Seetõttu valisime selle lncRNA edasiseks uurimiseks.
DARS-AS1 ekspressiooni uurimiseks patsientidel analüüsisime põhjalikult 10 327 kasvajaproovi vähigenoomi atlase (TCGA) projektist.Meie tulemused näitavad, et DARS-AS1 ekspresseerub laialdaselt ja oluliselt ülesreguleeritud tervetes rakkudes mitmesugustes kasvajates, sealhulgas käärsoole adenokartsinoom (COAD), neeru selge raku kartsinoom (KIRC) ja neerupapillaarrakuline kartsinoom (KIRP)..Väga vähesed (joonis 1d ja täiendav joonis 1a, b). Paaritud tervete/kasvaja proovide analüüs kinnitas veelgi DARS-AS1 oluliselt kõrgemat ekspressiooni põie uroteeli kartsinoomi (BLCA), neeru neeru selge rakukartsinoomi (KIRC), eesnäärme adenokartsinoomi (PRAD), kopsu lamerakulise kartsinoomi (LUSC) kasvajates. , emaka keha endomeetriumi kartsinoom (UCEC), kopsu adenokartsinoom (LUAD), maksa hepatotsellulaarne kartsinoom (LIHC), neeru neeru papillaarrakuline kartsinoom (KIRP) ja käärsoole adenokartsinoom (COAD) (p väärtus < 0,05) (joonis 1e–m) . Paaritud tervete/kasvaja proovide analüüs kinnitas veelgi DARS-AS1 oluliselt kõrgemat ekspressiooni põie uroteeli kartsinoomi (BLCA), neeru neeru selge rakukartsinoomi (KIRC), eesnäärme adenokartsinoomi (PRAD), kopsu lamerakulise kartsinoomi (LUSC) kasvajates. , emaka keha endomeetriumi kartsinoom (UCEC), kopsu adenokartsinoom (LUAD), maksa hepatotsellulaarne kartsinoom (LIHC), neeru neeru papillaarrakuline kartsinoom (KIRP) ja käärsoole adenokartsinoom (COAD) (p väärtus < 0,05) (joonis 1e–m) .Paaritud tervete / kasvajaproovide analüüs kinnitas ka DARS-AS1 oluliselt kõrgemat ekspressiooni põie uroteeli kartsinoomi (BLCA), selgerakulise neeru- ja neerurakulise kartsinoomi (KIRC), eesnäärme adenokartsinoomi (PRAD), kopsu lamerakulise kartsinoomi (LUSC) kasvajate korral., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , emakakeha endomeetriumi kartsinoom (UCEC), kopsu adenokartsinoom (LUAD), maksa hepatotsellulaarne kartsinoom (LIHC), neeru papillaarrakuline kartsinoom (KIRP) ja käärsoole adenokartsinoom (COAD) (p väärtus < < 0,05) (joon. 1e– m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着 更 高 ， ， 子宫体子宫 癌 （（UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， ， （（（LiHC） ， ， 肾 细胞癌 细胞癌 （（（（（（）））） 和结肠腺癌 （（（COAD））） （P 值<0,05）(图1e-m）).配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 更 高 表达 ， ， ， （（（（UCEC）） （（LUAD）） （（（（）） 细胞 细胞 细胞）） （（（（LIHC （（（癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Tervete / kasvajaga seotud proovide analüüs toetas veelgi DARS-AS1 rolli põie uroteeli kartsinoomi (BLCA), selgerakulise neerurakulise kartsinoomi (KIRC), eesnäärme adenokartsinoomi (PRAD) ja kopsu lamerakulise kartsinoomi (LUSC) kasvajate korral.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspressioon emakakehakartsinoomi (UCEC), kopsu adenokartsinoomi (LUAD), hepatotsellulaarse kartsinoomi (LIHC), neerupapillaarrakulise kartsinoomi (KIRP) ja käärsoole adenokartsinoomi (COAD) korral (p väärtus <0,05) (joonis 1e -m).Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et DARS-AS1 ekspresseerub laialdaselt ja tugevalt mitmesugustes vähivormides.
Kuna DARS-AS1 ja DARS (antisenss-ahelat kodeeriv geen) jagavad sama promootorit ja asuvad kõrvuti, kavandasime shRNA nii, et see hävitaks spetsiifiliselt DARS-AS1, kuid mitte DARS-i (täiendav joonis 2a, b ja täiendav tabel 2). .Lisaks SW620-le kasutasime shRNA knockdowni efektiivsuse ja funktsiooni uurimiseks ka kolme teist rakuliini, mis ekspresseerivad tugevalt DARS-AS1 (täiendav tabel 3).Meie tulemused näitasid, et kõik kolm arendatud shRNA-d saavutasid vähemalt 80% DARS-AS1 knockdown-tõhususe, mõjutades DARS-i mRNA kogust vähesel määral (täiendav joonis 2c–f).Lisaks leidsime, et DARS-AS1 knockdown nende shRNA-dega pärssis oluliselt rakkude kasvu kolorektaalse vähi rakuliinides SW620 (49,7%) ja HCT116 (27,7%), rinnavähi rakuliinis MBA-MD-231 (53,4%).) ja HepG2 hepatoomi rakuliin (92,7% vähenemine), samuti nende võime moodustada ankurdamata sfääre (keskmine vähenemine ~50,8%, 44,6%, 40,7% ja 75,7% rakuliini kohta) (joonis 2a, b).SW620 puhul kinnitasid kolooniate moodustumise testi tulemused veelgi, et DARS-AS1 shRNA inhibeeris oluliselt rakkude proliferatsiooni, vähenedes keskmiselt ligikaudu 69,6% (joonis 2c).
Kontroll-shRNA ja DARS-AS1 shRNA mõju rakkude proliferatsioonile (a) ja sferoidide moodustumisele (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231 ja HepG2 rakkudes.c Kontroll-shRNA ja DARS-AS1 shRNA mõju kolooniate moodustumisele SW620 rakkudes.DARS-AS1 üleekspresseerivate SW620 rakkude rakkude proliferatsioon (d), sferoidide moodustumine (e) ja kolooniate moodustumine (f).Näidatud andmed on kolme katse keskmine ± standardhälve.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 ja *** p ≤ 0,001 kahepoolse Studenti t-testi järgi.
Funktsioonikaotuse uuringute täiendamiseks lõime järgmisena SW620 rakud, mis üleekspresseerivad DARS-AS1 (täiendav joonis 2g).DARS-AS1 üleekspressioon suurendas SW620 rakkudes oluliselt rakkude kasvu (1,8 korda), ankurdamata sferoidide moodustumist (1,4 korda) ja kolooniate moodustumist (3,3 korda) (joonis 2d-f).Me kinnitasime selle tulemuse, kasutades teist DARS-AS1 ekspresseerivat rakuliini A549.Seda DARS-AS1 üleekspressioonist tingitud suurenenud rakkude proliferatsiooni täheldati veel A549 rakkudes (täiendav joonis 2h, i ja täiendav tabel 3).Kokkuvõttes näitavad need kasumi ja kahjumi uuringud, et DARS-AS1 soodustab vähirakkude proliferatsiooni in vitro .
Et uurida alusmehhanismi, mille abil DARS-AS1 reguleerib rakkude proliferatsiooni, teostasime RNA rippanalüüsi, et tuvastada selle potentsiaalsed valku siduvad partnerid.RT-qPCR tulemused näitasid, et umbes 86, 2% DARS-AS1-st asub SW620 rakkude tsütoplasmas (täiendav joonis 3a).In vitro transkribeeritud biotinüülitud DARS-AS1 või pseudoRNA-d inkubeeriti seejärel SW620 rakulüsaatidega, millele järgnes SDS-PAGE eraldamine.Järgnev hõbedaga värvimine näitas, et DARS-AS1 tõmbeproovides oli märkimisväärselt rikastatud selge riba (~ 38 kDa), kuid mitte näiv-RNA või helmeste proovides (joonis 3a).See riba tuvastati massispektromeetria (MS) abil kui PKR-i aktiveeriv valk (PACT) ja seda kinnitati täiendavalt immunoblotanalüüsiga SW620, HCT116 ja HepG2 rakuliinides (joonis 3a, b).DARS-i ja sellega seotud PACT-valkude – PKR ja TRBP – rikastamist uuriti ka RNA analüüsi abil Western blot analüüsiga (WB).Tulemused näitasid, et DARS-AS1 RNA ja nende kolme valgu vahel otsest koostoimet ei leitud (täiendav joonis 3b).Spetsiifilist interaktsiooni DARS-AS1 ja PACT vahel kinnitas veel RNA immunosadestamise (RIP) analüüs, mis näitas, et DARS-AS1 oli märkimisväärselt rikastatud PACT-vastaste antikehade, kuid mitte teiste kontroll-RNA-dega (joonis 3c).Et teha kindlaks, kas DARS-AS1 interakteerub otseselt PACT-ga muude rakukomponentide puudumisel, viidi läbi puhastatud PACT-i abil in vitro biokihi interferomeetria (BLI) test.Biotiiniga märgistatud DARS-AS1 või näiv RNA immobiliseeriti streptavidiini (SA) biosensoritele ja inkubeeriti seejärel kineetilises puhvris, mis sisaldas 1 μM PACT.Nimelt seostus PACT tugevalt DARS-AS1-ga (KD väärtus ~ 26, 9 nM), kuid mitte jäljendades RNA-d (joonis 3d).Kokkuvõttes näitavad need tulemused otsest koostoimet ja kõrget afiinsust DARS-AS1 ja PACT vahel.
RNA tõmbeanalüüs tuvastas, et DARS-AS1 interakteerub SW620 rakkudes PACT-ga.Eespool seotud valkude hõbedane värvimine.Madalamad immunoblotid viidi läbi anti-PACT antikehaga.b RNA tõmbamisanalüüs viidi läbi HCT116 (ülemine) ja HepG2 (alumine) rakkudes.PACT-i rikastamine tuvastati immunoblotanalüüsiga.cRNA immunosadestamise (RIP) testid viidi läbi SW620 rakkudes, kasutades näidatud antikehi.d PACT sidumiskõverad täispika DARS-AS1 või kontroll-RNA-ga saadi biokihi interferomeetria (BLI) abil.RNA immobiliseeriti streptavidiini biosensorile.Assotsiatsiooni mõõtmiseks kasutati 1 μM PACT.RNA tõmbamise test viidi läbi, kasutades biotinüülitud täispikka DARS-AS1 või kärbitud (ülemine).Immunoblot, mis näitab vastu võetud PACT-i (alumine).f Puhastatud märgistatud PACT inkubeeriti biotinüülitud täispika DARS-AS1-ga või kärbiti (nagu punktis e) in vitro RIP testi jaoks.Ekstraheeritud RNA-d kontrolliti RT-qPCR-ga.g Erinevate RNA fragmentide suhteline afiinsus PACT suhtes saadi biokihi interferomeetria abil.Analüüsiks kasutati 100 nM RNA-d ja 1 μM RAST-i.h In vitro RIP testid viidi läbi, kasutades puhastatud puutumata või kärbitud märgistatud PACT-i.Ekstraheeritud RNA-d kontrolliti RT-qPCR-ga.i DARS-AS1, PACT või mõlemat üleekspresseerivate SW620 rakkude kasvukiirus.j Täispika või kärbitud DARS-AS1 üleekspressioon SW620 rakkudes avaldas rakkude kasvule erinevat mõju.k Apoptoos tuvastati immunoblotimise teel PARP-vastase antikehaga.l DARS-AS1 väljatõrjumine kutsub esile SW620 rakkude apoptoosi, nagu näitab voolutsütomeetria.Näidatud andmed on kolme katse keskmine ± standardhälve. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, kahepoolse Studenti t-testiga. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, kahepoolse Studenti t-testiga. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kahepoolse Studenti t-testi järgi. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kahepoolse Studenti t-testi järgi.
Seejärel genereerisime in vitro transkriptsiooniga kolm biotinüülitud DARS-AS1 RNA fragmenti, et tuvastada PACT-i assotsiatsiooniks vajalik DARS-AS1 piirkond (joonis 3e).RNA analüüsi tulemused näitasid, et iga fragment oli võimeline PACT-ga interakteeruma, kuid 3'-otsa piirkonnas (384–768 nukleotiidi märgistusega A3) oli rohkem kui 1–384 nukleotiidi märgistusega A1) (joonis 3e).Sarnaseid tulemusi täheldati ka in vitro RIP testis, kasutades rekombinantset PACT-i (joonis 3f).Kooskõlas nende tulemustega näitasid katsed immobiliseeritud RNA fragmentide sidumiseks PACT-ga BLI abil ka seda, et PACT-l on suurem afiinsus A3 (384–768 nt) suhtes (KD väärtus ligikaudu 94,6 nM), samas kui peaaegu puuduvad seosed teiste piirkondadega.(joonis 3d).
Samuti uurisime PACT-is seotud sidumispiirkondi.PACT sisaldab kolme funktsionaalset domeeni, millest kaks on konserveerunud kaheahelalised RNA-siduvad domeenid (dsRBD) ja kolmas domeen (tähisega D3), mis toimib valkude interaktsioonide aktivaatorina.Iga domeeni lncRNA sidumisvõime uurimiseks konstrueerisime kolm mutatsiooni, mis eemaldasid kõik kolm domeeni ja viisime läbi in vitro RIP testi.Meie tulemused näitasid, et PACT-i kolmanda domeeni (D3) kustutamine vähendas oluliselt selle interaktsiooni DARS-AS1-ga (0,11 korda võrreldes intaktse PACT-iga) võrreldes kahe ülejäänud mutatsiooniga (joonis 3h), näidati, et vabanemine D3 suhtles DARSiga.-AC1.Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et DARS-AS1 ja PACT vaheline interaktsioon võib toimuda peamiselt DARS-AS1 3'-otsa ja PACT D3 domeeni kaudu.
Märkasime, et DARS-AS1 ei mõjutanud PACT ekspressiooni ja PACT ei mõjutanud DARS-AS1 (täiendav joonis 3c).Seejärel uurisime PACT knockdowni mõju rakkude kasvule.Erinevalt DARS-AS1-st kasvasid suhtelised rakud 1, 5–3 korda kiiremini, kui PACT maha löödi (täiendav joonis 3d).Kolooniate moodustumise testi tulemused näitasid, et rakud moodustasid pärast shRNA-ga töötlemist PACT-ga 2–3-kordseid kolooniaid (täiendav joonis 3e).Et testida, kas DARS-AS1 reguleerib rakkude proliferatsiooni PACTi kaudu, genereerisime SW620 rakud, mis üleekspresseerivad PACT, DARS-AS1 või mõlemat.PACT üleekspressioon näitas rakkude proliferatsiooni olulist pärssimist (joonis 3i).Kuigi DARS-AS1 üleekspressioon iseenesest soodustas oluliselt rakkude proliferatsiooni, ei olnud DARS-AS1 ja PACT üleekspresseerivate rakkude kasvukiiruses olulist erinevust.Need tulemused viitavad sellele, et PACT võib neutraliseerida DARS-AS1 üleekspressioonist põhjustatud suurenenud proliferatsiooni.
Kuna DARS-AS1 erinevatel piirkondadel on erinevad PACT-sidumisvõimed, uurisime nende suhtelist mõju rakkude proliferatsioonile DARS-AS1 fragmentide erineva üleekspressiooni kaudu.Võrreldes kahe teise fragmendiga, oli DARS-AS1 üleekspresseeritud 3'-otsas (384–768 nt), mis on DARS-AS1 peamine PACT-ga seotud piirkond, millel oli suurim võime stimuleerida rakkude proliferatsiooni (joonis 3j).Need tulemused näitavad positiivset korrelatsiooni DARS-AS1 seondumisvõime ja bioloogilise funktsiooni vahel.
On teatatud, et PACT on pro-apoptootiline valk19.Seetõttu uurisime DARS-AS1 mõju apoptoosile.Ootuspäraselt suurendas DARS-AS1 knockdown oluliselt PARP lõhustumist SW620 rakkudes ja suurendas anneksiin V-positiivsete rakkude osakaalu SW620, HCT116, HepG2 ja MBA-MD-231 rakuliinides (joonis 3k).3).3f – h), mis näitab, et DARS-AS1 anti-apoptootiline toime vähirakkudes on vastupidine PACT apoptoosi indutseerivale funktsioonile.Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et DARS-AS1 onkogeense funktsiooni mehhanism võib olla PACT funktsiooni pärssimine.
Järgmisena uurisime DARS-AS1-PACT assotsiatsiooni funktsionaalseid tagajärgi.On teatatud, et PACT aktiveerib PKR-i otsese interaktsiooni kaudu, mis suurendab seejärel eIF2α fosforüülimist, põhjustades translatsiooni deletsiooni ja apoptoosi17.Esiteks uurisime, kas DARS-AS1 mõjutab PACT ja PKR raku lokaliseerimist.Konfokaalne fluorestsentsmikroskoopia näitas, et PACT ja PKR olid SW620 rakkudes väga kolokaliseerunud keskmise Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendiga 0, 72.Samal ajal vähendas DARS-AS1 üleekspressioon märkimisväärselt PACT ja PKR kooslokaliseerimist (keskmine Pearsoni korrelatsioonikoefitsient 0, 61) (joonis 4a).Et uurida, kas DARS-AS1 võib moduleerida PACT-PKR interaktsiooni, teostasime SW620 rakulüsaatides PACT-vastase antikehaga kaasimmunosadestamise (co-IP) testi.PKR oli väga rikastatud anti-PACT-ga kontrollrakkudes, samas kui PKR-i taastumine vähenes oluliselt DARS-AS1 üleekspresseerivate rakkude lüsaatides (joonis 4b).Puhastatud märgistatud PACT-i ja PKR-i kasutati in vitro valkudega seondumise testides.Sellest tulenevalt näitasid need, mis andsid DARS-AS1, kuid mitte kontroll-RNA-d, allasurutud PACT-PKR interaktsiooni (joonis 4c).Kõik tulemused näitasid, et DARS-AS1 katkestas PACT ja PKR side.
Konfokaalse fluorestsentsmikroskoopia abil täheldati PACT ja PKR koospaiknemist kontrollrakkudes või DARS-AS1 üleekspresseerivates rakkudes.Tuumad värviti DAPI-ga.Statistilised tulemused saadi 16 foto põhjal.b Kaasimmunosadestamine (co-IP), kasutades anti-PACT antikeha SW620 kontrollrakkude rakulüsaatides või DARS-AS1 üleekspresseerivates rakkudes.c Märgistatud PACT-i, puhastatud PKR-i ja transkribeeritud in vitro DARS-AS1-ga või näidis-RNA-ga inkubeeriti in vitro valgu sidumise analüüsi jaoks.Immunosadestamiseks kasutati lipuvastaseid antikehi.d Immunoblotid näidatud antikehadega viidi läbi SW620 ja HCT116 rakkudes, mis olid transfekteeritud kontroll-shRNA või DARS-AS1-shRNA-ga, millele järgnes seerumi nälgimine.e DARS-AS1 ekspressioonitasemed muutsid raku tundlikkust tapsigargiini suhtes.SW620 rakud transfekteeriti DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 üleekspressiooniplasmiidi või kontrollplasmiidiga.Rakke töödeldi thapsigarginiga 48 tundi ja rakkude elujõulisus määrati MTS-reagendi abil.f In vitro aktiveerimistestiks ja immunobloti tuvastamiseks kasutati in vitro transkribeeritud DARS-AS1 või näivat RNA-d ja puhastatud PACT-i.g Immunoblotid, kasutades neid antikehi, viidi läbi SW620-ctrl rakkudel (vasakul) või rakkudel, mis üleekspresseerivad PKR mutante (paremal).Seejärel transfekteeriti need rakud kontroll-shRNA või DARS-AS1-shRNA-ga, millele järgnes seerumi nälgimine.h Voolutsütomeetria näitas, et mutantse PKR-i inaktiveerimine kompenseeris DARS-AS1-indutseeritud apoptoosi SW620 rakkudes.i Immunoblotid näidatud antikehadega viidi läbi SW620 (vasakul) või HCT116 (paremal) rakkudes.Kontroll-shRNA või DARS-AS1 shRNA-ga transfekteeritud rakud on ilma seerumita ja neile on lisatud 100 nM PKR C16 inhibiitorit või DMSO-d.Skaalariba = 5 µm.Näidatud andmed on kolme katse keskmine ± standardhälve.* p ≤ 0,05 kaheosaline Studenti t-test.
Üldiselt arvatakse, et kui PACT interakteerub PKR17-ga, saab Thr451 juures esile kutsuda PKR fosforüülimise.Meie tulemused näitasid, et PKR-i fosforüülimise tase oli pärast seerumi nälgimist DARS-AS1 knockdown-rakkudes oluliselt kõrgem (joonis 4d ja täiendav joonis 4a).Sellest lähtuvalt avastasime, et DARS-AS1 shRNA suurendas oluliselt ka eIF2α, peamise PKR-i substraadi fosforüülimist (joonis 4d ja täiendav joonis 4a).Thapsigargin on ER-stressor, mis põhjustab ER-i Ca2+ vabanemist.On teatatud, et ravi thapsigarginiga indutseerib PACT ekspressiooni ja aktiveerimist, mis täiendavalt interakteerub ja aktiveerib PKR-i, mis viib apoptoosini, suurendades eIF2α fosforüülimist18,61.Siin kasutasime thapsigarginit PACT / PKR raja stimulaatorina, et uurida, kas DARS-AS1 võib aidata rakkudel stressist üle saada, pärssides PACT / PKR rada.Me täheldasime, et DARS-AS1 ekspressiooni tase korreleerus positiivselt raku resistentsusega thapsigarginile.DARS-AS1 üleekspresseerivad SW620 rakud elasid paremini, kui neid raviti thapsigarginiga, samas kui DARS-AS1 knockdowniga rakud muutusid vastuvõtlikumaks (joonis 4e).Kooskõlas nende tulemustega vähendas DARS-AS1 üleekspressioon thapsigargin-indutseeritud PKR-i fosforüülimist (täiendav joonis 4b).Seevastu pärast thapsigarginiga töötlemist fosforüüliti PKR ja eIF2α DARS-AS1 knockdowni rakkudes suuremal määral kui kontrollrakkudes (täiendav joonis 4b).Huvitav on see, et thapsigargin indutseeris DARS-AS1 ekspressiooni annusest sõltuval viisil, mis võib viidata DARS-AS1 stressivastasele funktsioonile (täiendav joonis 4c).Lisaks teostasime nende tähelepanekute kinnitamiseks in vitro aktiveerimisanalüüse.Lühidalt, PKR puhastati rakulüsaatidest, kasutades PKR-vastast antikeha, seejärel inkubeeriti rekombinantse PACT ja in vitro transkribeeritud DARS-AS1-ga.Pärast ensümaatilist reaktsiooni tuvastati fosfo-PKR WB abil.Meie tulemused näitasid, et DARS-AS1 inhibeeris oluliselt PKR fosforüülimist, kuid mitte kontroll-RNA (joonis 4f).Need in vitro ja in vivo tulemused viitavad sellele, et DARS-AS1 inhibeerib PACT-vahendatud PKR aktivatsiooni.Samal ajal täheldasime ka PACT-i taastumise vähenemist DARS-AS1 juuresolekul (joonis 4f).See tulemus on kooskõlas in vitro valgu sidumise testi tulemustega (joonis 4c) ja illustreerib taas DARS-AS1 blokeerivat funktsiooni PACT-PKR assotsiatsiooni jaoks.
Ser246 ja Ser287 PACT D3 domeenis on vajalikud PKR aktiveerimiseks raku stressi all.Kahe seriinijäägi asendamine alaniiniga andis mutandi PACT-i (mutD), mis aktiveeris PKR-i stressi puudumisel, ja alaniini asendamine (mutA) muutis protokolli vastupidiseks.Kuna oleme näidanud selle domeeni olulisust otseses seoses DARS-AS1-ga, genereerisime need kaks PACT-mutanti, et testida, kas need jäägid võivad olla seotud ka interaktsiooniga DARS-AS1-ga.Huvitaval kombel kaotasid mõlemad mutandid DARS-AS1-ga seondumise võime (täiendav joonis 4d), mis viitab sellele, et tõhusaks interaktsiooniks DARS-AS1-ga võib olla vajalik PACT valgu täielik struktuur.
Lisaks viitavad meie tulemused ka sellele, et DARS-AS1-shRNA-indutseeritud rakkude proliferatsiooni pärssimist saab osaliselt taastada domineeriva negatiivse PACT-mutandi (PACTmutA) või domineeriva negatiivse PKR-mutandi (PKRmut) üleekspresseerimisega (täiendav joonis 4e.e).Dominant-negatiivsete PKR mutantide üleekspressioon vähendas DARS-AS1 knockdowni poolt indutseeritud PKR fosforüülimist, samuti eIF2α fosforüülimist seerumipuuduses rakkudes (joonis 4g).Veelgi olulisem on see, et DARS-AS1 knockdowniga indutseeritud apoptootiliste rakkude osakaal vähenes ka PKRmut-i üleekspresseerivates rakkudes (joonis 4h ja täiendav joonis 4g).PKR kinaasi aktiivsuse pärssimine kahjustab ka DARS-AS1 funktsiooni, kuna tulemused näitasid, et DARS-AS1 knockdown vallandas harva PKR ja eIF2α fosforüülimise, kui rakke töödeldi PKR-spetsiifilise C16 inhibiitoriga (joonis 4i ja täiendav joonis 4h).).Kokkuvõttes näitavad meie tulemused, et DARS-AS1 soodustab rakkude proliferatsiooni vähemalt osaliselt, inhibeerides PACT-vahendatud PKR aktivatsiooni.
DARS-AS1 rolli edasiseks uurimiseks tuumorigeneesis viisime läbi in vivo katsed, kasutades hiire ksenotransplantaadi mudelit. Tulemused näitavad, et DARS-AS1 pärssimine vähendas dramaatiliselt kasvaja kasvu hiirtel (p väärtus < 0,0001) (joonis 5a). Tulemused näitavad, et DARS-AS1 pärssimine vähendas dramaatiliselt kasvaja kasvu hiirtel (p väärtus < 0,0001) (joonis 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Tulemused näitavad, et DARS-AS1 knockdown vähendab drastiliselt kasvaja kasvu hiirtel (p väärtus <0,0001) (joonis 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис.). Tulemused näitasid, et DARS-AS1 knockdown vähendas oluliselt kasvaja kasvu hiirtel (p väärtus <0,0001) (joonis 5a).Seega vähenes DARS-AS1 knockdowni rühmas keskmine kasvaja maht märkimisväärselt umbes 72, 9% ja kasvaja keskmine mass umbes 87, 8% (joonis 5b–d).Need tulemused viitavad tugevalt sellele, et DARS-AS1 võib oluliselt soodustada kasvaja kasvu in vivo.
Reklaami DARS-AS1 knockdowni mõju kolorektaalsele onkogeneesile karvututel hiirtel.Näidatud on kasvukõverad (a), kasvaja suurus (b), kaal (c) ja kasvaja kujutised (d).Vearibad tähistavad ± SEM. n = 10. ****p < 0,0001, kahepoolse Studenti t-testi järgi. n = 10. ****p < 0,0001, kahepoolse Studenti t-testi järgi. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 kahepoolse Studenti t-test.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 kahepoolse Studenti t-test.Kaplan-Meier analüüsis korrelatsiooni DARS-AS1 ekspressioonitasemete ja üldise elulemuse vahel UVM-i, KICH-i, KIRP-i, MESO, GBM-i ja LGG-ga patsientidel.DARS-AS1 ekspressiooni kõrge tase patsientidel oli 50% hulgas;DARS-AS1 ekspressiooni madal tase patsientidel oli alumisel 50%.p-väärtused määrati logaritmi testi abil.f Kavandatud mudel, milles DARS-AS1 reguleerib PACT-PKR rada ja kasvaja kasvu.
DARS-AS1 kliinilise mõju paremaks mõistmiseks uurisime selle ekspressiooni ja patsiendi ellujäämise vahelist seost.TCGA andmekogumit analüüsides leidsime, et kõrgem DARS-AS1 ekspressioon oli seotud uveaalse melanoomi (UVM), neerukromofoobia (KICH), neerupapillaarrakulise kartsinoomi (KIRP), mesotelioomi (MESO), multipleksiga.Madalam elulemus oli märkimisväärselt seotud glioblastoomi morfoosiga (GBM) ja madala astme aju glioomiga (LGG) patsientidega (joonis 5e).Need tulemused viitavad sellele, et DARS-AS1 võib mängida olulist rolli kasvaja kliinilises progresseerumises ja võib olla potentsiaalne ennustav biomarker mitme vähi korral.
Selles uuringus, kasutades suuremahulist CRISPRi funktsionaalset sõeluuringut, tegime kindlaks, et DARS-AS1 lncRNA ületab vähirakkude stressi, reguleerides kahte peamist stressireageerijat, PACT ja PKR.Suheldes vahetult PACT-ga, inhibeeris DARS-AS1 PACT-vahendatud PKR-i aktivatsiooni, hoides sellega ära apoptootilist rakusurma ja soodustades rakkude proliferatsiooni (joonis 5f).DARS-AS1 ülesreguleerimist on täheldatud mitut tüüpi vähi puhul, mis viitab sellele, et selle funktsioon vähirakkude ellujäämise soodustamisel stressirohketes tingimustes võib olla laialdaselt rakendatav mitme vähitüübi puhul.
PACT on tuvastatud kui PKR aktivaatorvalk ja PACT-vahendatud PKR aktivatsioon mängib olulist rolli stressireaktsioonides, reguleerides transkriptsiooni, translatsiooni, apoptoosi ja muid olulisi rakulisi protsesse62.Aastakümneid on püütud mõista PACT-PKR kaskaadi vähispetsiifilist regulatsiooni.Siin näitas meie uuring erinevat PACT-PKR reguleerimise mehhanismi vähirakkudes rakulise lncRNA DARS-AS1 kaudu, mis seondub otseselt PACT-ga, blokeerib PACT-PKR interaktsiooni, inhibeerib PKR aktivatsiooni ja eIF2α fosforüülimist, inhibeerides seeläbi stressist põhjustatud apoptoosi ja stimuleerides vähi võimalikku vohamist.rakud.See avastus heidab valgust vähktõve prognoosi ja ravi võimalikele lncRNA sihtmärkidele.
Meie andmed näitasid, et DARS-AS1 knockdown sensibiliseerib rakud seerumi nälgimise suhtes, suurendades oluliselt fosforüülitud PKR ja eIF2α.Need tulemused viitavad sellele, et DARS-AS1 soodustab vähirakkude ellujäämist karmides tingimustes, inhibeerides PACT / PKR aktiivsust.Mitmed teised mittekodeerivad RNA-d, nagu ASPACT ja nc886, on samuti seotud PACT / PKR teljega, vähendades PACT48 mRNA-d või reguleerides autofosforüülimist, seondudes PKR49, 50, 64-ga.Nende hulgas toimib DARS-AS1 PACT-PKR ühenduse katkestajana.See uuring rikastab meie arusaamist PACT / PKR telje reguleerimisest ja lncRNA-de rollist stressireaktsioonides.
PACT sisaldab kolme eraldi domeeni.Igast kahest esimesest dsRBD-st piisab, et saavutada PACT kõrge afiinsusega seondumine PKR-ga, samas kui kolmas domeen (D3) on vajalik PKR aktiveerimiseks in vitro ja in vivo.Meie uuring näitas, et DARS-AS1 interakteerub eelistatavalt D3 domeeniga (joonis 3h).Arvestades lncRNA suurt suurust (768 nukleotiidi), võib DARS-AS1 seondumine D3-ga füüsiliselt inhibeerida dsRBD ja PKR PACT domeeni vahelist koostoimet, blokeerides seeläbi PACT ja PKR seose.PACT punktmutatsioonid, mis asendasid Ser246 ja Ser287 D3-s alaniini või aspartaadiga, häirisid selle seondumisafiinsust DARS-AS1 suhtes, osutades D3 üldiste struktuursete ja elektriliste omaduste tähtsusele nende seostes.Tulevikus on selle mehhanismi kohta vaja täiendavaid üksikasju, kasutades täpsemat biokeemilist analüüsi ja kõrge eraldusvõimega PACT struktuurianalüüsi.
Varasemad uuringud on teatanud, et DARS-AS1 soodustab rakkude proliferatsiooni mitme mehhanismi kaudu51,52,53.Ühes näites täheldasid uurijad, et DARS-AS1 reguleeris oma antisenss-valku kodeerivat DARS-i geeni, sihtides miP-194-5p neeruvähirakkudes.Kuid käesolevas uuringus avaldas DARS-AS1 knockdown vähe mõju DARS-i transkriptsioonile mitme vähitüübi, sealhulgas vähemalt kolorektaalse, rinna- ja maksavähi korral.Kuna lncRNA-del on raku- ja koespetsiifilised ekspressioonimustrid, ei pruugi funktsionaalsed mehhanismid vähitüüpide lõikes säilida, mis võib kaasa aidata sellele lahknevusele meie tähelepanekute ja erinevate vähivormide varasemate hinnangute vahel.Erinevate füsioloogiliste ja patoloogiliste protsesside spetsiifiliste mehhanismide väljaselgitamiseks on vaja spetsiaalseid uuringuid.
Kliiniliste andmete analüüs näitas, et DARS-AS1 ekspressioon kasvajates on pöördvõrdelises korrelatsioonis vähihaigete elulemusega, mis rõhutab DARS-AS1/PACT/PKR telje tähtsust vähi prognoosis.Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring näitab, et DARS-AS1 on PACT / PKR signaali telje regulaator, soodustab vähirakkude proliferatsiooni ja inhibeerib apoptoosi stressireaktsiooni ajal, mis pakub veel ühte uurimissuunda ja pakub huvi võimalike ravimeetodite tulevaste uuringute jaoks. .
Inimese rakuliinid SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ja HEK293T saadi Hiina riiklikust rakuliini ressursside infrastruktuurist.Kõiki rakke hoiti DMEM söötmes (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), millele oli lisatud 10% FBS-i (Gemini, Brooklyn, NY) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini (Thermo Fisher Scientific) temperatuuril 37 °C, 5% CO2.inkubaator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubuliin, CST (2128);tavaline hiire IgG, CST (5415S);normaalne küüliku IgG, CST (2729S).Antikehad lahjendati 1:1000 PBST-ga Western blot analüüsi jaoks ja 1:100 IP jaoks.
sgRNA-d töötati välja avalikult kättesaadava tööriista CRISPR-ERA66 abil.Kasutasime sgRNA arendamiseks tööriista vaikeparameetreid ja algoritm arvutas välja sgRNA sidumissaidid 3 kb piirkonnas.mille keskmes on TSS.SgRNA oligonukleotiidide kogumid sünteesiti ettevõttes CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ja klooniti humaniseeritud pgRNA plasmiididesse (Addgene #44248).Kokku 12 µg kombineeritud humaniseeritud pgRNA plasmiidi, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) ja 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) kaastransfekteeriti 5 x 106 HEK293T tassile, kasutades DNA Transfect 10 cm TransctionT tassi. rakud (CWBIO, Peking, Hiina) järgides tootja juhiseid.Viirust sisaldavad supernatandid koguti 48 ja 72 tundi pärast transfektsiooni ja filtreeriti läbi 0,45 µm filtri.Skriinimiseks saadi viiruse transduktsiooniga dCas9/KRAB sulandvalku ekspresseerivad SW620 rakud.Modifitseeritud SW620 rakud nakatati viiruse raamatukoguga neljas sõltumatus infektsioonikatses MOI-ga 0,1–0,3 ja nendest võeti 2 päeva jooksul proovid 2 μg/ml puromütsiiniga (Sigma, St. Louis, MO).Seejärel kultiveeriti rakke 18 päeva in vitro skriinimiseks minimaalse raamatukogu kattega 500 rakku/sgRNA kohta.
Genoomne DNA ekstraheeriti vastavalt QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Saksamaa; 51183) juhistele.Kokku kasutati raamatukogu ehitamiseks 100 μg genoomset DNA-d bioloogilise korduse kohta.SgRNA piirkonda amplifitseeriti kahe PCR vooruga ja seoti vöötkoodiga.
PCR tooted puhastati NucleoSpin® geeli ja PCR puhastuskomplektiga (MACHEREY-NAGEL, Düren, Saksamaa; 740609.250) ja kvantifitseeriti, kasutades Qubit™ HS kaheahelalise DNA tuvastamiskomplekti (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Rakkude proliferatsiooni mõõtmiseks kasutati MTS-testi.Rakud külvati 96 süvendiga plaatidele algtihedusega 2000 rakku süvendi kohta.Rakkude suhtelist arvu mõõdeti iga päev näidatud ajal kokku 4-6 päeva.Iga süvendi jaoks lahjendati 20 μl MTS reaktiivi (Promega) 100 μl DMEM-ga, inkubeeriti rakkudega 4 tundi temperatuuril 37 °C ja seejärel mõõdeti OD490.
Ankurdamata kasvu võime avastati sfääride moodustumist analüüsides.Lühidalt, 2000 rakku, mis olid transfekteeritud shRNA DARS-AS1 või kontroll-shRNA-ga, kultiveeriti ülimadala kinnitusega mikroplaatidel (Corning), kus söödet vahetati iga 4 päeva järel.Sferoidid loendati 14 päeva pärast.Võimendustestis kasutati 500 rakku, mis olid transfekteeritud DARS-AS1 üleekspressiooniplasmiidiga või kontrollplasmiidiga, vastasel juhul jäi meetod muutumatuks.
RNA transkribeerimiseks kasutati T7 RNA polümeraasi ja biotiin-16-UTP-d (Roche 1138908910) vastavalt Riboprobe® Combination Systemsi (Promega P1440) juhistele.Siin kasutatud praimerid on loetletud täiendavas tabelis 4.
Valku kodeerivad PACT- või PKR-piirkonnad klooniti pET15b-sse (Addgene #73619) ja transformeeriti BL21-sse (DE3).Baktereid inkubeeriti üleöö ampitsilliiniga varustatud LB-s ja seejärel lahjendati värske LB-ga 100 korda.Kui söötme OD600 jõudis 0,8-ni, lisati valgu ekspressiooni esilekutsumiseks 1 mM IPTG.Pärast üleöö inkubeerimist õrna loksutamisega (250 pööret minutis 20 °C juures) koguti rakusade tsentrifuugimisega (4000 p/min, 10 min, 4 °C).Resuspendeerige rakusade lüüsipuhvris (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ja inkubeerige jääl 30 minutit, seejärel töödelge ultraheliga (15 min, 5 s sisse/välja, jääl) ja tsentrifuugige (13 000). rpm)., 30 min, 4°С).Seejärel kanti supernatant Ni-NTA vaigule (QIAGEN) 3 korda temperatuuril 4 °C, pesti 4 korda pesupuhvriga (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidasool, 250 mM NaCl) ja elueeriti 3 korda, kokku 10 ml eluentpuhvrit (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidasool).Puhastatud valk määrati WB abil ja kontsentratsioon määrati Qubit™ valguanalüüsi komplekti (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) abil.
RIP testid viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud, muudatustega.Lühidalt, 1x RIP puhver (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasiini ribonukleaasi inhibiitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaas) lüüsib tsütostaatilist10 kokteili 1 x (Roche, 1 mM DTT) ja tsentrifuugige 13 000 pööret minutis 15 minutit temperatuuril 4 °C.Seejärel inkubeeriti supernatanti valgu A + G magnethelmestega (Millipore), mis olid konjugeeritud 5 μg anti-PACT antikehaga (Abeam) või IgG (CST).Helmeid pesti 5 korda 5x RIP puhvriga, seejärel digereeriti proteinaas K-ga (NEB).RNA ekstraheeriti Trizoliga ja määrati RT-qPCR abil.Praimerid on esitatud täiendavas tabelis 5.
In vitro RIP-analüüs viidi läbi vastavalt modifitseeritud standardsele RIP-analüüsi protokollile.Kokku 5 pmol in vitro transkribeeritud RNA-d lahjendati 1x RIP puhvriga ja anniiliti inkubeerimisega 65 °C juures 5 minutit, millele järgnes aeglane jahutamine toatemperatuurini.Kokku 5 pmol intaktseid või muteerunud lipuga märgistatud PACT valke puhastati E. coli-st.Inkubeerige renatureeritud RNA-ga 2 tundi temperatuuril 4 °C ja järgige ülaltoodud protseduuri lipuvastase IP analüüsi jaoks.
RNA pikendamise analüüsi jaoks lüüsiti 1x107 rakku 1xRIP puhvriga.Pärast tsentrifuugimist kiirusel 13 000 p / min 15 minutit temperatuuril 4 ° C töödeldi supernatanti 30 μl streptavidiini magnethelmestega (Beckman) 2 tundi temperatuuril 4 ° C.Seejärel lisati puhastatud lüsaat pärmi tRNA-ga ja inkubeeriti 40 pmol renatureeritud RNA-ga üleöö temperatuuril 4 °C, seejärel veel 2 tundi ja lisati 20 μl uusi BSA-ga blokeeritud streptavidiini magnethelmeid.Pesemisetapp koosnes 4 korda 5x RIP puhvriga ja 4 korda 1x RIP puhvriga.Vastavad valgud elueeriti biotiini elueerimispuhvriga (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotiin, PMSF) ja eraldati NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) abil.Pärast hõbedaga värvimist (Beyotime Biotechnology) lõigati teatud ribad välja ja analüüsiti MS-ga.
PACT ja PKR vahelise koostoime testimiseks viidi läbi Co-IP analüüs.Lühidalt, supernatandi lüsaadid valmistati inkubeerides 1 x 107 lüüsitud rakku 1 x RIP puhvris, millele järgnes tsentrifuugimine kiirusel 13 000 p/min 15 minutit temperatuuril 4 °C.Lüsaadid laaditi valgu A + G magnethelmestega, konjugeeriti 5 µg anti-PACT antikehaga ja pöörati õrnalt üle öö temperatuuril 4 °C.Helmeid pesti 3 korda 5 x RIP puhvriga, kaks korda 1 x RIP puhvriga ja elueeriti 1 x SDS puhvriga.Taastatud valku analüüsiti SDS-PAGE geeliga ja tuvastati WB abil.
Kaks pmol märgistatud PACT-i ja 1 pmol PKR-i puhastati E. coli-st.Lahjendage 1 × RIP puhvris ja inkubeerige 10 pmol renatureeritud RNA-ga 2 tundi 4 °C juures.Pärast seda inkubeeriti neid valgu A+G magnethelmestega konjugeeritud märgistamisvastase antikehaga veel kaks tundi.Seejärel pesti helmeid neli korda 1x RIP puhvriga ja elueeriti 1x SDS puhvriga.Saadud PACT ja PKR tuvastas WB.