Uudised

Täname, et külastasite veebisaiti Nature.com.Teie kasutataval brauseri versioonil on piiratud CSS-i tugi.Parima kasutuskogemuse saavutamiseks soovitame kasutada värskendatud brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiim).Seni renderdame saidi jätkuva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Ensümaatilisi lähedusmärgistamise meetodeid, mis põhinevad aktiveeritud estritel või fenoksüradikaalidel, kasutatakse laialdaselt subtsellulaarsete proteoomide ja valkude interaktsioonide kaardistamiseks elusrakkudes.Kuid aktiveeritud estrid on vähem reaktiivsed, mille tulemuseks on lai märgistusraadius, ja peroksiidiga töötlemisel tekkivad fenoksüradikaalid võivad häirida redoksradasid.Siin kirjeldame lähedusmärgistusest sõltuvat fotoaktivatsiooni (PDPL) meetodit, mis on välja töötatud miniSOG valgustundlikkust tekitava valgu geneetilise sidumise teel huvipakkuva valguga.Sinise valguse käivitamisel ja kokkupuuteaja kontrollimisel genereeritakse singlett hapnik ja seejärel saavutatakse aniliinisondiga histidiinijääkide spatiotemporally lahutatud märgistamine.Näitame selle kõrget täpsust organellispetsiifilise proteoomi kaardistamise kaudu.PDPL-i ja TurboID-i kõrvuti võrdlus näitab PDPL-i spetsiifilisemat ja põhjalikumat proteoomilist katvust.Järgmisena rakendasime PDPL-i haigusega seotud transkriptsiooni koaktivaatorile BRD4 ja E3 Parkini ligaasile ning leidsime varem tundmatud interaktorid.Üleekspressiooni sõeluuringuga tuvastati Parkini jaoks kaks tundmatut substraati, Ssu72 ja SNW1, mille lagunemist vahendab ubikvitinatsiooni-proteasoomi rada.
Valguvõrkude täpne iseloomustamine on paljude põhiliste rakuprotsesside aluseks.Seetõttu annab valkude interaktsioonide ülitäpne spatiotemporaalne kaardistamine molekulaarse aluse bioloogiliste radade, haiguspatoloogia dešifreerimiseks ja nende koostoimete katkestamiseks terapeutilistel eesmärkidel.Sel eesmärgil on väga soovitavad meetodid, mis suudavad tuvastada ajalisi interaktsioone elusrakkudes või kudedes.Afiinsuspuhastusmassispektromeetriat (AP-MS) on ajalooliselt kasutatud huvipakkuvate valkude (POI) seondumispartnerite tuvastamiseks.Kvantitatiivse proteoomika meetodite väljatöötamisega loodi Bioplex3.0, suurim AP-MS-il põhinev valguvõrkude andmebaas.Kuigi AP-MS on väga võimas, on rakkude lüüsi ja lahjendamise etapid töövoos kallutatud nõrkade ja mööduvate sidumisinteraktsioonide poole ning toovad sisse lüüsijärgseid artefakte, nagu võltsinteraktsioonipaarid, millel puudub enne lüüsimist lahjendus.
Nende probleemide lahendamiseks on välja töötatud ristsiduvate rühmadega ebaloomulikud aminohapped (UAA) ja ensümaatilised lähedalasuva märgistamise (PL) platvormid (nt APEX ja BioID)5.Kuigi UAA meetodit on edukalt rakendatud paljudes stsenaariumides ja see annab teavet otseste valguliimide kohta, on UAA sisestamiskoha optimeerimine siiski vajalik.Veelgi olulisem on see, et see on stöhhiomeetriline märgistamismeetod, millel puudub märgistamissündmuste katalüütiline ümberpööramine.Seevastu ensümaatilised PL-meetodid, nagu BioID meetod, sulatavad konstrueeritud biotiini ligaasi POI7-ga, mis seejärel aktiveerib biotiini, moodustades reaktiivse biotinüül-AMP estri vaheühendi.Ensüüm katalüüsib ja vabastab aktiveeritud biotiini "pilve", mis märgistab proksimaalseid lüsiinijääke.BioID vajab aga piisava märgistatud signaali saamiseks rohkem kui 12 tundi, mis välistab selle kasutamise ajalise eraldusvõimega.Kasutades pärmi kuvamisel põhinevat suunatud evolutsiooni, kujundati TurboID BioID põhjal tõhusamaks, võimaldades tõhusat märgistamist biotiiniga 10 minuti jooksul, võimaldades uurida dünaamilisemaid protsesse.Kuna TurboID on väga aktiivne ja endogeensed biotiini tasemed on madala taseme märgistamiseks piisavad, muutub taustamärgistamine potentsiaalseks probleemiks, kui eksogeense biotiini lisamine nõuab kõrgelt täiustatud ja ajastatud märgistamist.Lisaks on aktiveeritud estrid halvasti reaktiivsed (t1/2 ~5 min), mis võib viia suure märgistusraadiuseni, eriti pärast naabervalkude küllastamist biotiiniga 5. Teise lähenemisviisi kohaselt on konstrueeritud askorbaatperoksidaasi geneetiline liitmine (st biotiin- fenoolradikaale ja võimaldab valkude märgistamist ühe minuti jooksul9, 10. APEX-i kasutatakse laialdaselt subtsellulaarsete proteoomide, membraanivalgu komplekside ja tsütosoolsete signaalvalgu komplekside tuvastamiseks11, 12. Siiski võib vajadus kõrge kontsentratsiooni peroksiidide järele mõjutada redoksvalke või -radu, häirides rakulised protsessid.
Seega on olemasolevatele meetoditele oluline täiendus uus meetod, mis suudab genereerida suure ruumilise ja ajalise täpsusega reaktiivsemaid märgistatud raadiusega supressiooniliike, ilma rakulisi radu oluliselt häirimata. Reaktiivsete liikide hulgas äratas singletthapnik meie tähelepanu oma lühikese eluea ja piiratud difusiooniraadiuse tõttu (t1/2 <0,6 µs rakkudes)13. Reaktiivsete liikide hulgas äratas singletthapnik meie tähelepanu oma lühikese eluea ja piiratud difusiooniraadiuse tõttu (t1/2 <0,6 µs rakkudes)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени 3/201 жизни и онграниф Aktiivsete vormide hulgas äratas singletthapnik meie tähelepanu oma lühikese eluea ja piiratud difusiooniraadiuse tõttu (t1/2 < 0,6 µs rakkudes)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2揨京傉䈕葵s， 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого 22,0 времени жизнич и огра. Aktiivsete vormide hulgas köidab singletthapnik meie tähelepanu oma lühikese eluea ja piiratud difusiooniraadiuse tõttu (t1/2 <0,6 μs rakkudes).On teatatud, et üksikhapnik oksüdeerib juhuslikult metioniini, türosiini, histidiini ja trüptofaani, muutes selle polaarseks 14, 15 amiini- või tioolipõhiste sondide kinnitamiseks 16, 17 .Kuigi subtsellulaarse sektsiooni RNA märgistamiseks on kasutatud singletthapnikku, on endogeensete POI-lähedusmarkerite ümberpaigutamise strateegiad veel uurimata.Siin tutvustame platvormi, mida nimetatakse fotoaktivatsioonist sõltuvaks lähedusmärgistuseks (PDPL), kus kasutame sinist valgust miniSOG-valgustundlikkuse tekitajaga sulandatud POI-de valgustamiseks ja üksikute hapniku genereerimise käivitamiseks proksimaalsete jääkide oksüdeerimiseks, millele järgneb amiini sisaldavad modifikatsioonid keemiliste sondide oksüdeerimiseks. vahepealsed elusrakud..Testisime keemiliste sondide rühma, et maksimeerida sildi spetsiifilisust, ja tuvastasime modifitseerimiskohad, kasutades avatud proteoomika töövoogu.PDPL-i ja TurboID-i kõrvuti võrdlus näitab PDPL-i spetsiifilisemat ja põhjalikumat proteoomilist katvust.Rakendasime seda lähenemisviisi subtsellulaarse proteoomi organellispetsiifiliste markerite ja vähiga seotud epigeneetilise regulatoorse valgu BRD4 ja Parkinsoni tõvega seotud E3 ligaasi Parkini sidumispartnerite üldise proteoomi identifitseerimise suhtes, mis kinnitas nii teadaolevat kui ka tundmatut valguvõrgustikku. interaktsioonid..PDPL-i võime ära tunda E3 substraate suurtes valgukompleksides kujutab endast olukorda, kus on vaja kaudsete sideainete äratundmist.In situ on kinnitatud kaks tundmatut parkiini substraati, mida vahendab ubikvitinatsioon-proteasoom.
Fotodünaamiline teraapia (PDT)19 ja kromofooriga laserinaktiveerimine (CALI)20, mille puhul valguskiirgus fotosensibilisaatoritega tekitab üksiku hapniku, võib inaktiveerida sihtvalke või põhjustada rakusurma.Kuna singletthapnik on väga reaktiivne aine, mille teoreetiline difusioonikaugus on umbes 70 nm, saab reguleerida ruumiliselt piiratud oksüdatsiooni valgustundlikkuse tekitaja ümber.Sellest kontseptsioonist lähtudes otsustasime kasutada singletthapnikku, et saavutada elusrakkudes valgukomplekside tihe märgistamine.Oleme välja töötanud PDPL kemoproteoomilise lähenemisviisi nelja funktsiooni täitmiseks: (1) katalüüsida aktiivse singlethapniku teket sarnaselt PL ensümaatilisele lähenemisele;(2) pakkuma valguse initsiatsioonil ajaeraldusega märgistust;(3) muutmise teel (4) Vältige fooni vähendamiseks endogeensete kofaktorite (nagu biotiin) kasutamist või tugevalt häirivate eksogeensete reaktiivide (nt peroksiidide) kasutamist, et minimeerida rakkude kokkupuudet keskkonnastressiga.
Fotosensibilisaatorid võib jagada kahte kategooriasse, sealhulgas väikese molekulmassiga fluorofoorid (nt roos bengali, metüleensinine)22 ja geneetiliselt kodeeritud väikesed valgud (nt miniSOG, KillerRed)23.Modulaarse disaini saavutamiseks töötasime välja esimese põlvkonna PDPL platvormi, lisades POI24, 25-le fotosensibiliseerivad (PS) valgud (joonis 1a).Sinise valgusega kiiritamisel oksüdeerib singlett hapnik proksimaalsed nukleofiilsed aminohappejäägid, mille tulemuseks on umpolaarsus, mis on elektrofiilne ja võib edasi reageerida amiinisondi nukleofiilidega 16, 17.Sond on konstrueeritud alküünkäepidemega, mis võimaldab klõpsamise keemiat ja tõmmata alla LC/MS/MS iseloomustamiseks.
MiniSOG-i vahendatud valgukomplekside märgistamise skemaatiline illustratsioon.Sinise valgusega kokkupuutel tekitavad miniSOG-POI ekspresseerivad rakud singletthapnikku, mis muudab interakteeruvaid valke, kuid mitte mittesiduvaid valke.Fotooksüdatsiooni vaheproduktid püütakse kinni amiini keemilise sondi releemärgistega, moodustades kovalentseid adukte.Keemiasondil olev alkünüülrühm võimaldab klikkimise keemiat rikastamiseks rippmenüü abil, millele järgneb LC-MS/MS kvantifitseerimine.b Amiinsondide keemiline struktuur 1-4.c Mitokondriaalse lokaliseeritud miniSOG-vahendatud proteoomimarkerite tüüpiline fluorestsentsgeelanalüüs, kasutades sonde 1-4 ja suhtelist kvantifitseerimist geeli densitomeetria põhjal.Keemiliste sondide signaali-tausta suhet hinnati negatiivsete kontrollkatsete abil, välja arvatud sinine valgus, või kasutades HEK293T rakke ilma miniSOG ekspressioonita.n = 2 bioloogiliselt sõltumatut proovi.Iga punkt tähistab bioloogilist koopiat.d PDPL-i tüüpiline tuvastamine ja kvantifitseerimine optimeeritud sondi 3 abil näidatud PDPL-komponentide, nagu c., juuresolekul või puudumisel.n = 3 bioloogiliselt sõltumatut proovi.Iga punkt tähistab bioloogilist koopiat.Keskjooned ja vurrud tähistavad keskmist ja ± standardhälvet.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Singleti hapniku konfokaalne kujutis kaugpunase Si-DMA peitsiga.Skaalariba: 10 µm.Geeli pildistamist ja konfokaalseid katseid korrati sõltumatult vähemalt kaks korda sarnaste tulemustega.
Esmalt testisime HEK293T-s stabiilselt ekspresseeritud küpsete fotosensibilisaatorite miniSOG26 ja KillerRed23 võimet vahendada proteoomi propargüülamiini märgistamist keemilise sondina (täiendav joonis 1a).Geeli fluorestsentsanalüüs näitas, et miniSOG ja sinise valguse kiiritamise abil saavutati kogu proteoomi märgistamine, samas kui KillerRediga nähtavat märgistustoodet ei täheldatud.Signaali ja tausta suhte parandamiseks testisime seejärel keemiliste sondide komplekti, mis sisaldasid aniliini (1 ja 3), propüülamiini (2) või bensüülamiini (4).Me täheldasime, et HEK293T rakkudel endil oli kõrgem taustsignaal võrreldes sinise valguse puudumisega, mis võib olla tingitud endogeensest riboflaviini fotosensibilisaatorist, flaviini mononukleotiidist (FMN) 27 . Aniliinipõhised keemilised sondid 1 ja 3 andsid parema spetsiifilisuse, kusjuures HEK293T ekspresseeris stabiilselt miniSOG-d mitokondrites, näidates sondi 3 signaali > 8-kordset suurenemist, samas kui RNA-märgistusmeetodis CAP-seq kasutatud sond 2 näitas ainult ~2,5- kordades signaali suurenemine, mis on tõenäoliselt tingitud RNA ja valgu erinevatest reaktsioonivõime eelistustest (joonised 1b, c). Aniliinipõhised keemilised sondid 1 ja 3 andsid parema spetsiifilisuse, kusjuures HEK293T ekspresseeris stabiilselt miniSOG-d mitokondrites, näidates sondi 3 signaali > 8-kordset suurenemist, samas kui RNA-märgistusmeetodis CAP-seq kasutatud sond 2 näitas ainult ~2,5- kordades signaali suurenemine, mis on tõenäoliselt tingitud RNA ja valgu erinevatest reaktsioonivõime eelistustest (joonised 1b, c).Aniliinipõhised keemilised sondid 1 ja 3 näitasid paremat spetsiifilisust: HEK293T, mis ekspresseerib stabiilselt miniSOG-i mitokondrites, näitab sondi 3 signaali enam kui 8-kordset suurenemist, samas kui sond 2, mida kasutatakse CAP-seq RNA märgistusmeetodis näitab ~2,5-kordset signaali suurenemist, mis on tõenäoliselt tingitud RNA ja valgu erinevatest reaktsioonivõime eelistustest (joonis 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， ， HEK293T 在 中 中 中 稳定 稳定 稳定 表达 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加 增加 增加 ， ， ， ， ， 用 于 于 于 于 RNA 标记 标记 标记 方法 CAP-seq 的 2 仅 显示 ~ ~ 2,5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， ， HEK293T 在 稳定 稳定 稳定 稳定 表达 表达 MINISOG ， 探针 3 的 的 信号 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 于 于 于 RNA 标记 Cap-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAniliinil põhinevad keemilised sondid 1 ja 3 olid parema spetsiifilisusega, HEK293T ekspresseeris stabiilselt miniSOG-d mitokondrites ja sondil 3 oli signaali tõus üle 8-kordse, samas kui sond 2 CAP-seq RNA märgistusmeetodi jaoks näitas ainult ~ 2,5-kordset suurenemist.signaalis, tõenäoliselt RNA ja valgu erinevate reaktsioonieelistuste tõttu (joonis 1b, c).Lisaks testiti sondi 3 isomeere ja hüdrasiini sonde (sondid 5, 6, 7), mis kinnitasid sondi 3 optimeerimist (täiendav joonis 1b, c).Samamoodi näitas geelisisene fluorestsentsanalüüs teisi optimeeritud eksperimentaalseid parameetreid: kiirguse lainepikkus (460 nm), keemilise sondi kontsentratsioon (1 mM) ja kiiritusaeg (20 min) (täiendav joonis 2a–c).Mis tahes komponendi või sammu väljajätmine PDPL-protokollist põhjustas signaali olulise pöördumise taustale (joonis 1d).Nimelt vähenes valgu märgistamine märkimisväärselt naatriumasiidi või troloksi juuresolekul, mis teadaolevalt kustutavad singletthapnikku.D2O olemasolu, mis teadaolevalt stabiliseerib singletthapnikku, suurendab märgistussignaali.Teiste reaktiivsete hapnikuliikide panuse uurimiseks märgistamisel lisati mannitooli ja C-vitamiini, et luua vastavalt hüdroksüül- ja superoksiidradikaalide püüdjad, 18, 29, kuid ei leitud, et need vähendaksid märgistamist.H2O2 lisamine, kuid mitte valgustus, ei toonud kaasa märgistamist (täiendav joonis 3a).Fluorestsents-singlethapniku kujutis Si-DMA-sondidega kinnitas singletthapniku olemasolu HEK293T-miniSOG-juhtmes, kuid mitte algses HEK293T-juhtmes.Lisaks ei suutnud mitoSOX Red tuvastada superoksiidi tootmist pärast valgustamist (joonis 1e ja täiendav joonis 3b) 30. Need andmed viitavad kindlalt sellele, et singletthapnik on peamine reaktiivne hapnikuliik, mis vastutab järgneva proteoomilise märgistamise eest.PDPL-i tsütotoksilisust hinnati, sealhulgas sinise valguse kiiritamist ja keemilisi sonde, ning olulist tsütotoksilisust ei täheldatud (täiendav joonis 4a).
Märgistusmehhanismi uurimiseks ja valgukomplekside proteoomilise identifitseerimise võimaldamiseks LC-MS / MS abil peame kõigepealt kindlaks määrama, millised aminohapped on modifitseeritud ja sondi märgiste delta mass.On teatatud, et metioniini, histidiini, trüptofaani ja türosiini modifitseerib singletthapnik 14, 15 .Integreerime TOP-ABPP31 töövoo erapooletu avatud otsinguga, mida pakub FragPipe'i arvutusplatvorm, mis põhineb MSFragger32-l.Pärast üksikute hapniku modifitseerimist ja keemilise sondi märgistamist viidi läbi klikikeemia biotiini redutseerimismärgise abil, mis sisaldas lõhustatavat linkerit, millele järgnes neutravidiini venitamine ja trüpsiini seedimine.Modifitseeritud peptiid, mis oli endiselt vaiguga seotud, fotolõhustati LC-MS / MS analüüsi jaoks (joonis 2a ja täiendavad andmed 1).Kogu proteoomis toimus suur hulk modifikatsioone, loetletud oli üle 50 peptiidikaardi (PSM) vaste (joonis 2b).Üllataval kombel täheldasime ainult histidiini modifikatsiooni, mis oli tõenäoliselt tingitud oksüdeeritud histidiini suuremast reaktsioonivõimest aniliinisondide suhtes kui teised aminohapped.Vastavalt avaldatud histidiini oksüdatsiooni mehhanismile singletthapnikuga21,33 vastab väljapakutud delta-massi struktuur +229 Da sondi 3 aduktile 2-oksohistidiiniga pärast kahte oksüdatsiooni, samas kui +247 Da on hüdrolüüsi saadus. +229 Da (täiendav joonis 5).MS2 spektri hindamine näitas enamiku y ja b ioonide tuvastamise suurt usaldusväärsust, sealhulgas modifitseeritud fragmendi ioonide (y ja b) tuvastamist (joonis 2c).PDPL-ga modifitseeritud histidiinide lokaalse järjestuse kontekstianalüüs näitas väikeste hüdrofoobsete jääkide mõõdukat motiivieelistust ±1 positsioonides (täiendav joonis 4b).Keskmiselt tuvastati valgu kohta 1,4 histidiini ja nende markerite asukohad määrati lahustile ligipääsetava pinna (SASA) ja lahusti suhtelise kättesaadavuse (RSA) analüüsi abil (täiendav joonis 4c, d).
Erapooletu töövoog jääkselektiivsuse uurimiseks FragPipe'i arvutusplatvormi abil, mida toetab MSFragger.Lõhustatavaid linkereid kasutatakse Click-keemias, et võimaldada modifitseeritud peptiidide fotolõhustamist streptavidiini vaigust.Arvukate modifikatsioonide ja asjakohaste jäänuste tuvastamiseks käivitati avatud otsing.b Määrake kogu proteoomis esinevate modifikatsioonide mass.Peptiidide kaardistamine PSM.c Sondiga 3 modifitseeritud histidiini saitide MS2 spektraalne annotatsioon. Tüüpilise näitena lisati kovalentne reaktsioon sondiga 3 modifitseeritud aminohappele +229,0938 Da.d Mutatsioonianalüüs, mida kasutatakse PDPL-markerite testimiseks.PRDX3 (H155A, H225A) ja PRDX1 (H10A, H81A, H169A) transfekteeriti anti-Flag tuvastamiseks metsiktüüpi plasmiididega.e Sünteetiline peptiid pandi reageerima puhastatud miniSOG-ga sondi 3 juuresolekul ja vastavad produktid Δm +247 ja +229 märgiti LC-MS spektris.f In vitro valkudevahelised interaktsioonid, mis on modelleeritud miniSOG-6xHis-märgise ja anti-6xHis antikehaga.Antibiotiini (streptavidiin-HRP) ja sondiga 3 märgistatud miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikehakomplekside hiirevastane Western blot analüüs, sõltuvalt valgusega kokkupuute ajast.Üksikute valkude märgised on väljendatud vastavas molekulmassis: LC antikeha kerge ahel, HC antikeha raske ahel.Neid katseid korrati sõltumatult vähemalt kaks korda sarnaste tulemustega.
Märgistuskoha biokeemiliseks kontrollimiseks muudeti massispektromeetria abil tuvastatud PRDX3 ja PRDX1 histidiinilt alaniiniks ja võrreldi transfektsioonianalüüsides metsiktüübiga.PDPL tulemused näitasid, et mutatsioon vähendas oluliselt märgistamist (joonis 2d).Vahepeal sünteesiti avatud otsinguga tuvastatud peptiidjärjestused ja reageeriti in vitro puhastatud miniSOG-ga sondi 3 ja sinise valguse juuresolekul, saades produktid massinihkega +247 ja +229 Da, kui need tuvastati LC-MS-ga (joonis fig. . 2e).).Et testida, kas interakteeruvaid proksimaalseid valke saab vastusena miniSOG fotoaktivatsioonile märgistada in vitro, kavandasime miniSOG-6xHis valgu ja anti-His monoklonaalse antikeha vahelise interaktsiooni in vitro kunstliku lähedustesti (joonis 2f).Selles testis eeldasime antikeha raskete ja kergete ahelate proksimaalset märgistamist miniSOG-ga.Tegelikult näitasid hiirevastased (mis tunnevad ära anti-6xHis-märgistatud antikeha rasked ja kerged ahelad) ja streptavidiini Western blot analüüsid raskete ja kergete ahelate tugevat biotinüülimist.Nimelt märkasime miniSOG-i autobiotinüülimist 6xHis-märgise ja kergete ja raskete ahelate vaheliste ristsidemete tõttu, mis võib olla seotud eelnevalt kirjeldatud lõhega lüsiini ja 2-oksohistidiini proksimaalse vastuse vahel.Kokkuvõtteks järeldame, et PDPL muudab histidiini lähedusest sõltuval viisil.
Meie järgmine eesmärk oli iseloomustada subtsellulaarset proteoomi, et testida in situ märgistamise spetsiifilisust.Seetõttu ekspresseerisime stabiilselt miniSOG-i HEK293T-rakkude tuumas, mitokondriaalses maatriksis või ER-i välismembraanis (joonis 3a).Geeli fluorestsentsanalüüs näitas rohkesti märgistatud ribasid kolmes subtsellulaarses asukohas ja ka erinevaid märgistusmustreid (joonis 3b).Fluorestsentskujutise analüüs näitas PDPL kõrget spetsiifilisust (joonis 3c).PDPL-i töövoogule järgnesid klõpsreaktsioonid rodamiinvärvidega, et piiritleda rakusisesed proteoomid fluorestsentsmikroskoopia abil, ja PDPL-signaalid kolokaliseeriti DAPI, mitokondriaalsete jälgimisseadmete või ER-jälgijatega, mis kinnitas PDPL-i kõrget täpsust.Kolme organelli asukoha puhul näitas PDPL-i ja TurboID-i kõrvuti võrdlus avidiini Western blot'iga, et PDPL märgistati spetsiifilisemalt võrreldes nende vastavate kontrollidega.PDPL-i tingimustes ilmus rohkem märgistatud ribasid, mis näitab rohkem PDPL-märgistatud valke (täiendav joonis 6a-d).
miniSOG-vahendatud organellispetsiifilise proteoomi märgistamise skemaatiline esitus.miniSOG sihib mitokondriaalset maatriksit inimese COX4 (mito-miniSOG) N-terminaalse 23 aminohappega sulandumise kaudu, tuuma H2B-ga (tuum-miniSOG) ja Sec61β ER-membraani tsütoplasmaatilise külje kaudu (ER-miniSOG) ).Näidustused hõlmavad geelkujutist, konfokaalset kujutist ja massispektromeetriat.b Kolme organelli-spetsiifilise PDPL-profiili tüüpilised geelpildid.CBB Coomassie briljantsinine.c Tüüpilised konfokaalsed kujutised HEK293T rakkudest, mis ekspresseerivad stabiilselt miniSOG-d erinevate subtsellulaarsete lokalisatsioonidega, mille tuvastas V5 (punane) märgistatud antikeha.Subtsellulaarseid markereid kasutatakse mitokondrite ja ER (roheline) jaoks.PDPL-i töövoog hõlmab miniSOG-ga (kollane) märgistatud subtsellulaarsete proteoomide tuvastamist Cy3-asiidklõpsu keemia abil.Skaalariba: 10 µm.d PDPL-märgistatud proteoomide vulkaanilised graafikud erinevates organellides, mis on kvantifitseeritud märgistamata kvantifitseerimisega (n = 3 sõltumatut bioloogilist katset).Vulkaanialadel kasutati kahe sabaga Studenti t-testi.Negatiivse kontrollina kasutati metsiktüüpi HEK293T. Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja >2-kordne ioonide intensiivsuse erinevus). Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja >2-kordne ioonide intensiivsuse erinevus). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja >2-kordne erinevus ioonide intensiivsuses).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja > 2-kordne ioontugevuse erinevus).HEK293T-miniSOG jaoks olulised, kuid HEK293T jaoks mitteolulised seotud valgud on näidatud roheliselt.e Katsete proteoomiliste andmekogumite spetsiifilisuse analüüs d.Statistiliselt oluliste valkude koguarv igas organellis (punased ja rohelised täpid) on märgitud ülaosas.Histogrammid näitavad mitoCarta 3.0, GO analüüsi ja A. Tingi jt põhjal organellides lokaliseeritud valke.inimesed.Eraldi andmestikud mitokondrite, tuumade ja ER jaoks.Neid katseid korrati sõltumatult vähemalt kaks korda sarnaste tulemustega.Toorandmed esitatakse algandmefailide kujul.
Geeli ja pildistamise tulemuste julgustamisel kasutati igas organellis tuvastatud proteoomi kvantifitseerimiseks märgistuseta kvantifitseerimist (täiendavad andmed 2).Taustamarkerite lahutamiseks kasutati transfekteerimata HEK293T negatiivse kontrollina. Vulkaani graafiku analüüs näitas oluliselt rikastatud valke (p < 0,05 ja> 2-kordne ioonide intensiivsus) ning üksikuid valke, mis esinevad ainult miniSOG-i ekspresseerivates joontes (joonis 3d punased ja rohelised punktid). Vulkaani graafiku analüüs näitas oluliselt rikastatud valke (p < 0,05 ja> 2-kordne ioonide intensiivsus) ning üksikuid valke, mis esinevad ainult miniSOG-i ekspresseerivates joontes (joonis 3d punased ja rohelised punktid). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkaandiagrammi analüüs näitas oluliselt rikastatud valke (p<0,05 ja >2-kordne ioonide intensiivsus) ning üksikuid valke, mis esinevad ainult miniSOG-d ekspresseerivates joontes (joonis 3d, punased ja rohelised punktid).火山图 分析 显示 出 显着 富集 蛋白质 蛋白质.火山图 分析 显示 出 显着 蛋白质 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子）） 仅 存 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 在于 表达 系 的 蛋白质 蛋白质 （（（（（（3D 红色 绿色点 。。。 。。。 。。。））））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkaanidiagrammi analüüs näitas oluliselt rikastatud valke (p<0,05 ja >2x ioontugevust) ning üksikuid valke, mis esinesid ainult miniSOG ekspressiooniliinis (punased ja rohelised punktid joonisel 3d).Neid andmeid kombineerides tuvastasime vastavalt 1364, 461 ja 911 statistiliselt olulist tuuma-, mitokondriaalset ja ER välismembraani valku.Organellides lokaliseeritud PDPL täpsuse analüüsimiseks kasutasime MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analüüsi ja A. Ting et al.mitokondrite, tuuma ja ER jaoks kasutati andmekogumit8, et testida tuvastatud valkude organellide spetsiifilisust, mis vastab täpsusele 73,4, 78,5 ja 73,0% (joonis 3e).PDPL-i spetsiifilisus kinnitab, et PDPL on ideaalne vahend organellispetsiifiliste proteoomide tuvastamiseks.Nimelt näitas identifitseeritud mitokondriaalsete valkude esitakondriaalne analüüs, et püütud proteoom jaotus peamiselt maatriksis ja sisemembraanis (vastavalt 226 ja 106), moodustades 91, 7% (362) tuvastatud mitokondriaalsete valkude koguarvust.lisaks kinnitati PDPL kõrge tase (täiendav joonis 7a).Samamoodi näitas subnukleaarne analüüs, et püütud proteoom jaotus peamiselt tuumas, nukleoplasmas ja tuumas (täiendav joonis 7b).Tuuma proteoomiline analüüs tuuma lokaliseerimise signaalpeptiidiga (3xNLS) näitas sarnast täpsust H2B konstruktsiooniga (täiendav joonis 7c-h).PDPL-markeri spetsiifilisuse määramiseks valiti tuuma laminiin A diskreetsemalt lokaliseeritud POI7 lõksuks.PDPL tuvastas 36 oluliselt rikastatud valku, millest 12 valku (30,0% sh A-lamin) olid hästi iseloomustatud lamina A interakteeruvad valgud, millele on lisatud Stringi andmebaasi märkused ja mille protsent oli suurem kui BioID meetodil (122 valku) 28/28. , 22.9 %) 7. Meie meetod tuvastas vähem valke, võib-olla piiratud märgistusalade tõttu, mida võimaldas aktiivsem singletthapnik.GO analüüs näitas, et tuvastatud valgud paiknesid peamiselt nukleoplasmas (26), tuumamembraanis (10), tuumamembraanis (9) ja tuuma poorides (5).Kokkuvõttes moodustasid need tuumas lokaliseeritud valgud 80% rikastatud valkudest, mis näitab veelgi PDPL-i spetsiifilisust (täiendav joonis 8a–d).
Olles kindlaks teinud PDPL-i võime teostada organellides lähedusmärgistust, testisime seejärel, kas PDPL-i saab kasutada POI-d siduvate partnerite analüüsimiseks.Eelkõige püüdsime määratleda tsütosoolsete valkude PDPL-analüüsi, mida peetakse nende väga dünaamilise olemuse tõttu raskemaks sihtmärgiks kui nende membraani lokaliseeritud kolleegid.Bromodomeen ja ekstraterminaalne (BET) valk BRD4 on pälvinud meie tähelepanu oma võtmerolli tõttu erinevates haigustes 35, 36 .BRD4 moodustatud kompleks on transkriptsiooni koaktivaator ja oluline terapeutiline sihtmärk.Reguleerides c-myc ja Wnt5a transkriptsioonifaktorite ekspressiooni, arvatakse, et BRD4 on ägeda müeloidse leukeemia (AML), hulgimüeloomi, Burkitti lümfoomi, käärsoolevähi ja põletikuliste haiguste võtmeteguriks 37, 38.Lisaks on mõned viirused, nagu papilloomiviirus, HIV ja SARS-CoV-236,39, suunatud BRD4-le, et reguleerida viiruse ja raku transkriptsiooni.
BRD4 interaktsiooni kaardistamiseks PDPL-i abil kombineerisime miniSOG-i BRD4 lühikese N- või C-terminaalse isovormiga.Proteoomilised tulemused näitasid kahe konstruktsiooni suurt kattumist (täiendav joonis 9a).MiniSOG-H2B-ga tuvastatud tuumaproteoom katab 77, 6% BRD4-ga interakteeruvatest valkudest (täiendav joonis 9b).Seejärel kasutati markeri raadiuse reguleerimiseks erinevaid valgustusaegu (2, 5, 10, 20 min) (joonis 4a ja lisaandmed 3).Me järeldame, et lühematel fotoperioodidel märgistab PDPL peamiselt otseseid sidumispartnereid, samas kui pikemad perioodid hõlmavad valke, mis tuvastatakse lühemate fotoaktiveerimisperioodide ajal, ja kaudseid sihtmärke märgistuskompleksides.Tegelikult leidsime külgnevate ajapunktide vahel tugeva kattuvuse (84,6% 2 ja 5 minuti puhul; 87,7% 5 ja 10 minuti puhul; 98,7% 10 ja 20 minuti puhul) (joonis 4b ja täiendav joonis 9c).Kõigis katserühmades ei leidnud me mitte ainult BRD4 isemärgistust, vaid stringide andmebaasis märkmeid mitmete tuntud sihtmärkidega, nagu MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ja HMGB1.Nende sihtmärkide ioontugevus on võrdeline kokkupuuteajaga (joonis 4c ja täiendav joonis 9d).2-minutilises rühmas tuvastatud valkude GO analüüs näitas, et tuvastatud valgud paiknesid tuumas ja osalesid kromatiini ümberkujundamises ja RNA polümeraasi funktsioonis.Valgu molekulaarne funktsioon oli rikastatud kromatiini sidumise või transkriptsioonilise koaktivatsiooniga, mis on kooskõlas BRD4 funktsiooniga (joonis 4d).Stringi andmebaasi toega valkude interaktsioonianalüüs näitas BRD4 ja HDAC perekonda interakteeruvate komplekside, nagu SIN3A, NCOR2, BCOR ja SAP130 vahelist kaudsete interaktsioonide esimest taset (joonis 4e ja täiendav joonis 9e), mis on kooskõlas BRD4 ja HDAC-i siduvate atsetüülitud histoonidega. ..Lisaks kinnitati Western blot analüüsiga LC-MS/MS abil tuvastatud tüüpilised sihtmärgid, sealhulgas Sin3A, NSUN2, Fus ja SFPQ (joonis 4f).Hiljuti on teatatud, et BRD4 lühike isovorm moodustab tuumad, millel on vedeliku ja vedeliku faasi eraldamise (LLPS) omadused.RNA-d siduvad valgud Fus ja SFPQ vahendavad erinevate rakuliste protsesside LLPS-i ja on siin tuvastatud kui registreerimata BRD4 siduvad valgud.BRD4 ja SFPQ vahelist koostoimet kinnitasid kaasimmunosadestamise (co-IP) katsed (joonis 4g), mis viitab teisele BRD4-vahendatud vedeliku-vedeliku faasi eraldamise mehhanismile, mis väärib edasist uurimist.Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et PDPL on ideaalne platvorm teadaolevate BRD4 interakteeruvate ja tundmatute siduvate valkude tuvastamiseks.
a miniSOG-vahendatud BRD4 lähedusmärgistuse skemaatiline esitus, kokkupuuteajad: 2, 5, 10 ja 20 min.b Erinevatel valgustusaegadel tuvastatud valkude kattumine.HEK293T-miniSOG-BRD4-s tuvastatud valgu rikastamine oli metsiktüüpi HEK293T-ga võrreldes statistiliselt oluline.c Ioonide intensiivsus märgistamata tüüpiliste teadaolevate BRD4-siduvate valkude kvantifitseerimisel kindlaksmääratud kokkupuuteaja jooksul.n = 3 bioloogiliselt sõltumatut proovi.Andmed on esitatud kui keskmine ± standardhälve.d 2-minutilises rühmas tuvastatud valkude geeniontoloogiline analüüs (GO).Loetletud on kümme esimest GO-terminit.Mullid on värvitud vastavalt GO terminikategooriale ja mullide suurus on võrdeline igas terminis leitud valkude arvuga.e BRD4-ga interakteeruvate valkude stringianalüüs.Kollased ringid on otseliim ja hallid ringid on esimene kaudliimi kiht.Punased jooned tähistavad eksperimentaalselt määratud interaktsioone ja sinised jooned tähistavad ennustatud interaktsioone.f LC-MS/MS-is tuvastatud tüüpilised BRD4 sidumise sihtmärgid kontrolliti Western blot analüüsiga.g Kaasimmunosadestamise katsed kinnitavad SFPQ ja BRD4 vahelist koostoimet.Neid katseid korrati sõltumatult vähemalt kaks korda sarnaste tulemustega.Toorandmed esitatakse algandmefailide kujul.
Lisaks registreerimata POI-ga seotud sihtmärkide tuvastamisele oletame, et PDPL sobib ensüümide substraatide tuvastamiseks, mis eeldaks kaudsete siduvate valkude iseloomustamist suurtes kompleksides, et märkida registreerimata substraadid.Parkin (kodeeritud PARK2-ga) on E3 ligaas ja parkini mutatsioonid põhjustavad teadaolevalt autosomaalset retsessiivset juveniilset Parkinsoni tõbe (AR-JP)42.Lisaks on parkiini kirjeldatud kui olulist mitofagia (mitokondriaalse autofagia) ja reaktiivsete hapnikuliikide eemaldamise jaoks.Kuigi on tuvastatud mitu parkiini substraati, jääb parkiini roll selles haiguses ebaselgeks.Iseloomustamata substraatide märkimiseks testiti PDPL-i, lisades parkini N- või C-otsa miniSOG-i.Parkiini aktiveerimiseks PINK1-Parkini raja kaudu töödeldi rakke karbonüültsüaniidi prootoni transporteriga m-klorofenüülhüdrasooniga (CCCP).Võrreldes meie BRD4 PDPL tulemustega, näitas parkiini N-otsa liitmine suuremat sihtvalkude komplekti, kuigi see hõlmas suuremat osa C-otsast (177 210-st) (joonis 5a, b ja täiendavad andmed 4).tulemus on kooskõlas aruannetega, et N-terminali sildid võivad Parkin44 aberrantselt aktiveerida.Üllataval kombel oli meie andmetes Parkin43 avaldatud AP-MS tulemustega ainult 18 kattuvat valku, mis on tõenäoliselt tingitud rakuliinide ja proteoomika töövoogude erinevustest.Lisaks neljale teadaolevale valgule (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ja PSMC3), mis on tuvastatud kahe meetodiga (joonis 5c)43.LC-MS/MS tulemuste edasiseks kinnitamiseks kasutati PDPL-ravi ja sellele järgnevat Western blot analüüsi, et võrrelda HEK293T vanemraku testi ja stabiilse N-terminaalse parkiiniliini tulemusi.Varem tundmatuid sihtmärke CDK2, DUT, CTBP1 ja PSMC4 testiti teadaoleva sideainega DNAJB1 (joonis 5d).
Parkiiniga interakteeruvate valkude vulkaanidiagramm HEK293T rakkudes stabiilselt ekspresseeritud miniSOG-ga, mis on sulandatud parkiini N- või C-otsaga (n = 3 sõltumatut bioloogilist katset).Vulkaanialadel kasutati kahe sabaga Studenti t-testi.Negatiivse kontrollina kasutati HEK293T. Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja >2-kordne ioonide intensiivsuse erinevus). Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja >2-kordne ioonide intensiivsuse erinevus). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja >2-kordne erinevus ioonide intensiivsuses).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Oluliselt muutunud valgud on punasega esile tõstetud (p < 0,05 ja > 2-kordne ioontugevuse erinevus).HEK293T-miniSOG jaoks olulised, kuid HEK293T jaoks mitteolulised seotud valgud on näidatud roheliselt.b Venni diagramm, mis näitab kattuvaid valke N-terminaalse ja C-terminaalse konstruktsiooni vahel.N-terminaalsed märgised võivad parkini aberrantselt aktiveerida ja tekitada paremini äratuntavaid valke.c Venni diagramm, mis näitab kattuvaid valke PDPL ja AP-MS vahel.Loetletud on teadaolevad interaktorid, sealhulgas 4 18-st kattuvast valgust ja 11 159-st PDPL-is spetsiifiliselt tuvastatud valgust.d LC-MS/MS abil tuvastatud tüüpilised sihtmärgid kontrolliti Western blot analüüsiga.e Ssu72 ja SNW1 tuvastati registreerimata parkiini substraatidena.Need FLAG-märgistatud valguplasmiidid transfekteeriti HEK293T-sse ja HEK293T-Parkin-miniSOG-sse, millele järgnes CCCP-ravi erinevatel ajahetkedel.Degradatsioon oli rohkem väljendunud Parkini üleekspressiooniliinis.f Kasutades proteasoomi inhibiitorit MG132, kinnitati, et Ssu72 ja SNW1 lagunemisprotsessi vahendab proteasoomi ubikvitinatsioon.Neid katseid korrati sõltumatult vähemalt kaks korda sarnaste tulemustega.Toorandmed esitatakse algandmefailide kujul.
Eelkõige peavad PDPL-i poolt tuvastatud valgud sisaldama parkini siduvaid valke ja nende substraate.Registreerimata parkiini substraatide tuvastamiseks valisime seitse tuvastatud valku (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ja SNW1) ja transfekteerisime plasmiidid, et paljastada need geenid normaalsele HEK293T-le ja stabiilselt ekspresseerida miniSOG-Parkini tõbe, millele järgnes HEK293-ravi.Ssu72 ja SNW1 valkude tasemed olid stabiilses miniSOG-Parkini liinis oluliselt vähenenud (joonis 5e).12-tunnine töötlemine CCCP-ga põhjustas mõlema substraadi kõige olulisema lagunemise.Et uurida, kas Ssu72 ja SNW1 lagunemist reguleerib proteasoomi ubikvitinatsioon, lisati proteasoomi aktiivsuse pärssimiseks proteasoomi inhibiitor MG132 ja tegelikult avastasime, et nende lagunemisprotsess oli pärsitud (joonis 5f).Täiendavad mitte-substraadi sihtmärgid kinnitati Parkini interaktoritena, kasutades Western blot analüüsi (täiendav joonis 10), mis näitas LC-MS/MS-ga järjekindlaid tulemusi.Kokkuvõtteks võib öelda, et PDPL-i töövoo integreerimine sihtvalgu transfektsiooni kontrollimisega võimaldab tuvastada registreerimata E3 ligaasi substraate.
Oleme välja töötanud ühise lähedusmärgistuse platvormi, mis võimaldab tuvastada ruumis ja ajas interakteeruvaid POI-sid.Platvorm põhineb miniSOG valgustundlikkust suurendaval valgul, mis on vaid umbes 12 kDa, vähem kui poole väiksem kui küpse APEX2 ensüümi suurus (27 kDa) ja kolmandik TurboID suurusest (35 kDa).Väiksem suurus peaks oluliselt laiendama väikeste valgu interaktoomide uurimise rakenduste valikut.Singlethapniku kvantsaagise suurendamiseks ja selle lähenemisviisi tundlikkuse laiendamiseks on vaja täiendavaid fotosensibilisaatoreid, olgu need siis geneetiliselt kodeeritud valgud või väikesed molekulid, täiendavalt uurida.MiniSOG praeguse versiooni puhul saab kõrge ajalise eraldusvõime saavutada lähedusmarkerite aktiveerimiseks sinise valgustusega.Lisaks vabastas pikem kokkupuuteaeg suurema üksiku hapniku pilve, mille tulemuseks oli distaalsemate histidiinijääkide modifitseerimine, märgistusraadiuse suurenemine ja PDPL-i ruumilise eraldusvõime peenhäälestus.Testisime ka seitset keemilist sondi, et suurendada signaali ja tausta suhet, ja uurisime selle lähenemisviisi taga olevat molekulaarset mehhanismi.TOP-ABPP töövoog koos erapooletu avatud otsinguga kinnitas, et modifikatsioonid toimusid ainult histidiinides ja suurenenud histidiini modifikatsioonide puhul ei täheldatud ühtset mikrokeskkonda, välja arvatud histidiinide mõõdukas eelistus ahela piirkonnas.
PDPL-i on kasutatud ka subtsellulaarsete proteoomide iseloomustamiseks, mille proteoomi spetsiifilisus ja katvus on vähemalt võrreldavad teiste lähedusmärgistamise ja organellispetsiifiliste keemilise sondi meetoditega.Lähedusmarkereid on edukalt kasutatud ka pinna, lüsosomaalsete ja sekretoomiga seotud proteoomide iseloomustamiseks 46, 47.Usume, et PDPL ühildub nende subtsellulaarsete organellidega.Lisaks vaidlustasime PDPL-i, tuvastades tsütosoolse valgu sidumise sihtmärgid, mis on nende dünaamiliste omaduste ja ajalisemate interaktsioonide tõttu keerulisemad kui membraaniga seotud valgud.PDPL-i rakendati kahele valgule, transkriptsioonilisele koaktivaatorile BRD4 ja haigusega seotud ligaasile E3 Parkin.Need kaks valku valiti mitte ainult nende põhiliste bioloogiliste funktsioonide, vaid ka nende kliinilise tähtsuse ja terapeutilise potentsiaali tõttu.Nende kahe POI jaoks tuvastati nii tuntud sidumispartnerid kui ka registreerimata sihtmärgid.Eelkõige kinnitas faaside eraldamisega seotud valku SFPQ co-IP, mis võib viidata uuele mehhanismile, mille abil BRD4 (lühike isovorm) reguleerib LLPS-i.Samal ajal usume, et Parkini substraatide tuvastamine on stsenaarium, mille puhul on vaja kaudsete liimide tuvastamist.Tuvastasime kaks identifitseerimata parkiini substraati ja kinnitasime nende lagunemist mööda ubikvitinatsiooni-proteasoomi rada.Hiljuti on hüdrolaasi substraatide tuvastamiseks välja töötatud mehhanismipõhine püüdmisstrateegia, püüdes need ensüümidega kinni.Kuigi see on väga võimas meetod, ei sobi see suurte komplekside moodustumisel osalevate substraatide analüüsiks ning eeldab kovalentsete sidemete moodustamist ensüümi ja substraadi vahel.Eeldame, et PDPL-i saab laiendada, et uurida teisi valgukomplekse ja ensüümide perekondi, näiteks deubikvitinaasi ja metalloproteaasi perekondi.
On välja töötatud uus miniSOG-i vorm, mida nimetatakse SOPP3-ks, täiustatud hapnikutootmisega.Võrdlesime miniSOG-i SOPP3-ga ja leidsime parema märgistuse, kuigi signaali-müra suhe jäi muutumatuks (täiendav joonis 11).Me oletasime, et SOPP3 optimeerimine (nt suunatud evolutsiooni kaudu) tooks kaasa tõhusamad fotosensibiliseerivad valgud, mis nõuavad lühemat valgusaega ja võimaldavad seega jäädvustada dünaamilisemaid rakuprotsesse.Eelkõige on PDPL-i praegune versioon piiratud rakukeskkonnaga, kuna see nõuab sinist valgust ega suuda tungida sügavatesse kudedesse.See funktsioon välistab selle kasutamise loommudelite uuringutes.Optogeneetika kombineerimine PDPL-iga võib aga anda võimaluse loomuuringuteks, eriti ajus.Lisaks eemaldavad selle piirangu ka teised konstrueeritud infrapuna valgustundlikkust suurendavad ained.Selles valdkonnas on praegu käimas uuringud.
HEK293T rakuliin saadi ATCC-st (CRL-3216).Rakuliini testimisel oli mükoplasmainfektsioon negatiivne ja seda kultiveeriti DMEM-is (Thermo, #C11995500BT), millele oli lisatud 10% veise loote seerumit (FBS, Vistech, #SE100-B) ja 1% penitsilliini/streptomütsiini (Hyclone, #SV30010).sisse kasvanud.
3-aminofenüleen (proov 3) ja (4-etünüülfenüül)metaanamiin (proov 4) osteti firmalt Bidepharm.Propüülamiin (sond 2) osteti ettevõttest Energy-chemicals.N-(2-aminofenüül)pent-4-üünamiid (sond 1) sünteesiti vastavalt avaldatud meetoditele.
Täiendav tabel 1 loetleb selles uuringus kasutatud geneetilised konstruktsioonid.MiniSOG ja KillerRed järjestused klooniti P. Zou (Pekingi ülikool) kingitusplasmiidist.Mitokondriaalse maatriksi sihtjärjestus tuletati COX4 23 N-terminaalsest aminohappest ja klooniti näidatud vektoritesse, kasutades Gibsoni komplekti (Beyotime, #D7010S).Endoplasmaatilise retikulumi membraani ja tuuma sihtimiseks amplifitseeritakse SEC61B inimese DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) PCR-iga HEK293T rakkude cDNA raamatukogust ja H2B DNA (annetanud D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ja kloonitud, nagu eespool mainitud.Kui pole teisiti näidatud, amplifitseeriti HEK293T raku cDNA raamatukogust PCR-ga teised transfektsiooniks ja stabiilsete rakuliinide konstrueerimiseks kasutatud valgugeenid.G3S (GGGS) ja G4S (GGGGS) kasutati linkeritena söödavalgu ja miniSOG vahel.Nendele liitkonstruktsioonidele lisati V5 epitoobimärgis (GKPIPNPLLGLDST).Imetajatel ekspresseerimiseks ja stabiilse rakuliini loomiseks subklooniti miniSOG fusioonkonstrukt pLX304 lentiviiruse vektorisse.Bakteriaalseks ekspressiooniks klooniti miniSOG pET21a vektorisse, mis oli märgistatud 6xHis C-otsas.
HEK293T rakud külvati 2,0 x 105 rakku süvendi kohta kuue süvendiga plaatidele ja transfekteeriti 24 tundi hiljem rekombinantsete lentiviiruse plasmiididega (2,4 μg pLX304) ja viiruse pakkimisplasmiididega (1,5 μg psPAX2 ja 1,2 μg psPAX2 ja 1,2 μg 0MD-ga p0MD28o.Gtime), kasutades p0MDBeyo8o. , #C0533), umbes 80% fusioon.Pärast üleöö transfektsiooni söödet vahetati ja inkubeeriti veel 24 tundi.Viiruse kogumine viidi läbi 24, 48 ja 72 tunni pärast.Enne sihtrakuliinide nakatamist filtriti viiruskeskkond läbi 0,8 μm filtri (Merck, #millex-GP) ja lisati polübreeni (Solarbio, #H8761) kontsentratsioonini 8 μg/ml.24 tunni pärast lasti rakkudel söödet vahetades taastuda.Rakud valiti madalama range valikuna, kasutades esimese kolme passaaži jaoks 5 μg/ml blastitsidiini (Solarbio, #3513-03-9).Seejärel kasutati järgmise kolme lõigu jaoks rangema režiimina 20 μg/ml.
Rakud külvati 12-süvendilistesse kambritesse (Ibidi, #81201) tihedusega ligikaudu 20 000 rakku süvendi kohta.HEK293T-rakkude adhesiooni parandamiseks lisage 50 ug/ml fibronektiini (Corning, #356008), mis on lahjendatud fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS, Sangon, #B640435) temperatuuril 37 °C.Kambreid töödeldi 1 tund ja eemaldati seejärel PBS-iga.24 tunni pärast pesti rakke üks kord PBS-ga, inkubeeriti 1 mM sondiga 3 värskes Hanksi tasakaalustatud soolalahuses (HBSS, Gibco, #14025092) 1 tund temperatuuril 37 °C ja seejärel inkubeeriti sinise LED-iga (460 nm). ).) kiiritati 10 minutit toatemperatuuril.Pärast seda pesti rakke kaks korda PBS-ga ja fikseeriti 4% formaldehüüdiga PBS-is (Sangon, #E672002) 15 minutit toatemperatuuril.Liigne formaldehüüd eemaldati fikseeritud rakkudest, pestes kolm korda PBS-ga.Seejärel rakud permeabiliseeriti 0,5% Triton X-100-ga (Sangon, #A600198) PBS-is ja pesti 3 korda PBS-ga.Seejärel eemaldage kamber ja lisage igale proovile 25 µl klikireaktsioonisegu, mis sisaldab 50 µM Cy3-asiidi (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4). ja 0,5 mg/ml naatriumaskorbaati (Aladdin, nr S105024) ning inkubeeriti 30 minutit toatemperatuuril.Pärast kiirreaktsiooni pesti rakke kuus korda PBS-ga, mis sisaldas 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ja seejärel blokeeriti 5% BSA-ga (Abcone, #B24726) PBST-s 30 minutit toatemperatuuril.
Kolokalisatsiooniga immunovärvimiseks inkubeeriti rakke primaarsete antikehadega vastavalt näidatud tingimustele: hiire V5-märgise vastane mAb (1:500, CST, #80076), küüliku anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABklonaalne, #A0564), küüliku polüklonaalne anti-kalneksiini antikeha (1:500, Abcam, #ab22595) või küüliku anti-lamin A/C monoklonaalne antikeha (1:500; CST, #2032) temperatuuril 4 °C üleöö.Pärast 3-kordset pesemist PBST-ga inkubeeriti rakke sekundaarsete antikehadega: kitse küülikuvastane Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) lahjendati 1:1000, kitse hiirevastane Alexa Fluor 594 (CST, #8889) lahjendati 1:100.lahjendamine Lahjendage toatemperatuuril 30 minutit.Seejärel pesti rakke 3 korda PBST-ga ja vastavärviti DAPI-ga (Thermo, #D1306) PBS-is 10 minutit toatemperatuuril.Pärast 3 pesemist PBS-ga suleti rakud pildistamiseks 50% glütseroolis (Sangon, #A600232) PBS-is.Immunofluorestsentskujutised saadi ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokaalse mikroskoobi ja ZNE 3.5 tarkvara abil.
Ühekordse hapniku fluorestseeruva pildistamise jaoks pesti rakke kaks korda Hanksi HEPES puhvriga enne 100 nM Si-DMA lisamist Hanksi HEPES puhvris (DOJINDO, # MT05).Pärast valgusega kokkupuudet inkubeeriti rakke CO2 inkubaatoris 37 °C juures 45 minutit.Seejärel pesti rakke kaks korda Hanksi HEPES puhvriga ja värviti Hoechstiga Hanksi HEPES puhvris 10 minutit toatemperatuuril ja visualiseeriti ZEISS LSM 900 konfokaalse mikroskoobi abil., #M36008) kaltsiumi ja magneesiumi sisaldavas HBSS puhvris.Pärast kokkupuudet valguse või doksorubitsiiniga (MCE, #HY-15142A) inkubeeriti rakke CO2 inkubaatoris temperatuuril 37 °C 10 minutit, pesti kaks korda HBSS puhvriga ja inkubeeriti koos Hoechstiga HBSS puhvris toatemperatuuril.minutit.Doksorubitsiini kasutati positiivse sondi kontrollina, kus rakke töödeldi 20 μM doksorubitsiiniga HBSS-s, mis sisaldas 1% BSA-d 30 minutit.Immunofluorestsentskujutised saadi Zeiss LSM 900 konfokaalse mikroskoobi abil.
Stabiilselt mito-miniSOG-i ekspresseerivad HEK293T rakud külvati 15 cm tassidesse umbes 30% tihedusega.48 tunni pärast, kui saavutati ~80% konfluentsus, pesti rakke üks kord PBS-ga, inkubeeriti 1 mM Probe 3-ga värskes HBSS puhvris 1 tund temperatuuril 37 °C ja seejärel valgustati toas 10 minutit sinise LED-iga. temperatuuri..Seejärel pesti rakke kaks korda PBS-ga, kaabiti ja resuspendeeriti jääkülmas PBS puhvris, mis sisaldas EDTA-vabu proteaasi inhibiitoreid (MCE, #HY-K0011).Rakud lüüsiti, töödeldes otsa 1 minuti jooksul ultraheliga (1 sekund sisse ja 1 sekund välja 35% amplituudiga).Saadud segu tsentrifuugiti prahi eemaldamiseks kiirusel 15 871 xg 10 minutit temperatuuril 4 °C ja supernatandi kontsentratsioon reguleeriti 4 mg/ml-ni, kasutades BCA valguanalüüsi komplekti (Beyotime, #P0009).Kombineerige 1 ml ülaltoodud lüsaati 0,1 mM fotolaguneva biotiinasiidiga (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligandiga (Aladdin, #T162437) ja 1 mM CuSO4 inkubaatoriga põhjaga inkubaatoriga. Pöörake 1 tund toatemperatuuril.Pärast kiirreaktsiooni lisage segu eelnevalt segatud lahusele (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) 10 ml klaasviaalis.Proove segati ja tsentrifuugiti 4500 g juures 10 minutit toatemperatuuril.Alumine ja ülemine lahus visati ära, sadet pesti kaks korda 1 ml metanooliga ja tsentrifuugiti 15871 × g juures 5 minutit temperatuuril 4 °C.Sademe lahustamiseks lisage 1 ml 8 M uureat (Aladdin, nr U111902) 25 mM ammooniumvesinikkarbonaadis (ABC, Aladdin, nr A110539).Proove taastati 10 mM ditiotreitooliga (Sangon, #A100281 25 mM ABC-s) 40 minutit temperatuuril 55 °C, millele järgnes 15 mM värske jodoatseetamiidi (Sangon, #A600539) lisamine toatemperatuuril pimedas.Alküleerimine 30 minuti jooksul..Reaktsiooni peatamiseks lisati veel 5 mM ditiotreitooli.Valmistage iga proovi jaoks ette ligikaudu 100 µl NeutrAvidin agaroosigraanuleid (Thermo, #29202), pestes neid kolm korda 1 ml PBS-ga.Ülaltoodud proteoomilahus lahjendati 5 ml PBS-ga ja inkubeeriti eelpestud NeutrAvidin agaroosigraanulitega 4 tundi toatemperatuuril.Seejärel pesti helmeid 3 korda 5 ml PBS-ga, mis sisaldas 0,2% SDS-i (Sangon, #A600485), 3 korda 5 ml PBS-ga, mis sisaldas 1 M uureat, ja 3 korda 5 ml ddH2O-ga.Seejärel koguti helmed tsentrifuugimisega ja resuspendeeriti 200 μl 25 mM ABC-s, mis sisaldas 1 M uureat, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) ja 20 ng/μl trüpsiini (Promega, # V5280).Trüpsiniseerige öö läbi 37 °C juures pöörlemisega.Reaktsioon peatati sipelghappe (Thermo, # A117-50) lisamisega, kuni pH saavutas 2-3.Helmeid pesti 3 korda 1 ml PBS-ga, mis sisaldas 0,2% SDS-i, 3 korda 1 ml PBS-iga, mis sisaldas 1 M uureat, ja seejärel 3 korda 1 ml destilleeritud veega.Modifitseeritud peptiidid vabastati kerge lüüsiga (365 nm) 90 minuti jooksul, kasutades 200 μl 70% MeOH-d.Pärast tsentrifuugimist koguti supernatant.Seejärel pesti helmeid üks kord 100 μl 70% MeOH-ga ja supernatandid ühendati.Proove kuivatati Speedvac vaakumkontsentraatoris ja säilitati analüüsimiseni temperatuuril -20 °C.
Singlettide hapnikuga modifitseeritud peptiidide tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks lahustati proovid uuesti 0,1% sipelghappes ja 1 μg peptiide analüüsiti massispektromeetriga Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, mis oli varustatud Tune'i nano-ESI allikaga ja müüja tarkvara 4.3 Xcalibur.Proovid eraldati 75 µm × 15 cm sisemiselt pakitud kapillaarkolonnis 3 µm C18 materjaliga (ReproSil-pur, #r13.b9.) ja ühendati EASY-nLC 1200 UHPLC süsteemiga (Thermo).Peptiidid eraldati lineaarse 95-minutilise gradientkromatograafiaga 8% lahustist B kuni 50% lahustini B (A = 0,1% sipelghapet vees, B = 0,1% sipelghapet 80% atsetonitriilis), seejärel suurendati lineaarselt 98% B min. 6 minutiga voolukiirusel 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos kogub andmeid vaheldumisi täieliku MS-skannimise ja MS2-skannimise vahel olenevalt andmetest.Pommitamispingeks määrati 2,1 kV ja ioonide transpordikapillaari temperatuur oli 320°C.MS spektrid (350-2000 m/z) koguti eraldusvõimega 120 000, AGC 4 × 105 ja maksimaalse sisestusajaga 150 ms.Kümme kõige levinumat mitmekordselt laetud prekursorit igas täielikus skaneerimises killustati HCD abil, mille normaliseeritud kokkupõrkeenergia oli 30%, kvadrupoolne isolatsiooniaken 1, 6 m / z ja eraldusvõime seade 30 000.AGC sihtmärk tandem-massispektromeetria jaoks, kasutades 5 × 104 ja maksimaalset sisestusaega 150 ms.Dünaamiline erand on seatud 30 sekundile. Määramata ioonid või need, mille laeng oli 1+ ja >7+, lükati MS/MS puhul tagasi. Määramata ioonid või need, mille laeng oli 1+ ja >7+, lükati MS/MS puhul tagasi. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määramata ioonid või ioonid laenguga 1+ ja >7+ lükati MS/MS puhul tagasi.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määratlemata ioonid või ioonid laengutega 1+ ja >7+ lükati MS/MS puhul tagasi.
Algandmeid töödeldakse FragPipe'i arvutusplatvormi abil, mis põhineb MSFraggeril.Massi nihked ja vastavad aminohapped määrati avatud otsingu algoritmi abil, mille prekursori massi taluvus oli -150 kuni 500 Da.Seejärel tuvastati modifitseeritud peptiidid, kasutades histidiini modifikatsioone massikasvuga +229,0964 ja +247,1069 Da PD-s (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Kondenseeritud miniSOG geeni stabiilselt ekspresseerivad rakud plaaditi 6 cm tassidele.~ 80% liitumise saavutamisel pesti rakke üks kord HBSS-ga (Gibco, #14025092), seejärel inkubeeriti keemiliste sondidega HBSS-s 1 tund 37 °C juures ja valgustati sinise valgusega.10 W LED 20 minutit toatemperatuuril.Et teha kindlaks, millist tüüpi reaktiivsed hapniku liigid on seotud PDPL-iga, 0,5 mM C-vitamiini (MCE, #HY-B0166), 5 mM Troloxi (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Rakkudele lisati toidulisanditena 100 mM mannitooli (Energy Chemical, #69-65-8), 100 µM H2O2, 10 mM NaN3.Pärast külma PBS-ga pesemist kaabiti rakud, koguti 1, 5 ml tsentrifuugituubidesse ja töödeldi otsaga ultraheliga 1 minut 200 μl PBS-is koos 1x proteaasi inhibiitoriga ilma EDTAta (1 s ja 1 s ilma, amplituud 35%).Saadud segu tsentrifuugiti kiirusel 15 871 x g 10 minutit temperatuuril 4 °C ja supernatandi kontsentratsioon reguleeriti 1 mg/ml-ni, kasutades BCA valguanalüüsi komplekti.Ligikaudu 50 µl ülaltoodud lüsaati inkubeeriti 0,1 mM rodamiinasiidiga (Aladdin, nr T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandi ja 1 mM CuSO4-ga 1 tund toatemperatuuril, pöörates alt üles.Pärast klõpsamisreaktsiooni viidi läbi atsetooniga sadestamine, lisades proovidele 250 μl eeljahutatud atsetooni, inkubeerides -20 °C juures 20 minutit ja tsentrifuugides 6010 × g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C.Koguge pellet kokku ja keetke 50 µl 1x Laemmli puhvris 10 minutit temperatuuril 95 °C.Seejärel analüüsiti proove SDS-PAGE pikkadel geelidel ja visualiseeriti Bio-rad ChemiDoc MP Touch pildisüsteemi ja Image Lab Touch tarkvara abil.
Rekombinantse miniSOG-6xHis valgu ekspressioon ja puhastamine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.Lühidalt, E. coli BL21(DE3) rakud (TransGen, #CD701-02) transformeeriti pET21a-miniSOG-6xHis-ga ja valgu ekspressioon indutseeriti 0,5 mM IPTG-ga (Sangon, #A600168).Pärast rakkude lüüsimist puhastati valgud Ni-NTA agaroosigraanulitega (MCE, nr 70666), dialüüsiti PBS vastu ja säilitati temperatuuril –80 °C.
Antikehapõhise in vitro märgise lähedusanalüüsi jaoks segage 100 μM puhastatud miniSOG, 1 mM sond 3 ja 1 μg märgistamisvastast hiire monoklonaalset antikeha (TransGen, #HT501-01) PBS-is reaktsiooni kogumahuni 50 μl..Reaktsioonisegu kiiritati sinise LED-valgusega 0, 2, 5, 10 ja 20 minutit toatemperatuuril.Segu inkubeeriti 0,1 mM biotiin-PEG3-asiidiga (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandiga ja 1 mM CuSO4-ga 1 tund toatemperatuuril ülespoole liikuval loksutil.Pärast kiirreaktsiooni lisage 4x Laemmli puhver otse segule ja keetke 95 °C juures 10 minutit.Proove analüüsiti SDS-PAGE geelidel ja analüüsiti Western blot meetodil streptavidiin-HRP-ga (1:1000, Solarbio, #SE068).
Lähedal asuva peptiidipõhise in vitro märgistamise analüüsimiseks kasutati histidiini sisaldavat sünteetilist C-terminaalse amidatsiooniga peptiidi (LHDALDAK-CONH2).Selles testis segati 100 µM puhastatud miniSOG, 10 mM sondi 3 ja 2 µg/ml sünteetilist peptiidi PBS-is reaktsiooni kogumahus 50 µl.Reaktsioonisegu kiiritati toatemperatuuril 1 tund sinise LED-valgusega.Ühte mikroliitrit proovi analüüsiti LC-MS süsteemiga (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight massispektromeeter koos MassLynxi spektrianalüüsi tarkvaraga).
MiniSOG sulandgeeni stabiilselt ekspresseerivad HEK293T rakud külvati 10 cm tassidesse erineva organelli lokaliseerimisega liinide jaoks (Mito, ER, Nucleus) ja 15 cm tassidesse Parkin-miniSOG ja BRD4-miniSOG liinide jaoks.~ 90% konfluentsuse saavutamisel pesti rakke üks kord HBSS-iga, seejärel inkubeeriti sondiga 3 HBSS-s 1 tund temperatuuril 37 °C ja valgustati toatemperatuuril 10 W sinise LED-iga.Parkini mittekontaktseks märgistamiseks lisati 10 uM prootonkarbonüültsüaniidi kandja m-klorofenüülhüdrasoon CCCP (Solarbio, #C6700) koos sondiga 3 HBSS-s 1 tunniks temperatuuril 37 °C.Rakkude lüüsi, klikikeemia, redutseerimise ja alküülimise etapid olid samad, mis ülalpool kirjeldatud, välja arvatud see, et lisati 2 mg lüsaati ja fotolaguneva biotiinasiidi asemel kasutati klikireaktsioonis biotiin PEG3 asiidi.Pärast rikastamist pesti helmeid 3 korda 5 ml PBS-ga, mis sisaldas 0,2% SDS-i, 3 korda 5 ml PBS-ga, mis sisaldas 1 M uureat, ja 3 korda 5 ml PBS-ga.Seejärel lisati 2 µg trüpsiini 300 µl 25 mM ABC-le, mis sisaldas 1 M uureat, et lõhustada valku üleöö temperatuuril 37 °C.Reaktsioon peatati sipelghappe lisamisega, kuni saavutati pH 2-3.Pärast helmestel trüpsiinimist eemaldati peptiidi lahusest sool, kasutades SOLAµ HRP kolonni (Thermo, #60209-001) ja kuivatati Speedvac vaakumkontsentraatoris.Peptiidid lahustati uuesti 0, 1% sipelghappes ja 500 ng peptiide analüüsiti massispektromeetriga Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, mis oli varustatud ülalkirjeldatud nano-ESI allikaga.Peptiidid eraldati kaubanduslikel RP-HPLC eelkolonnidel (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr 164946) ja analüütilistel RP-HPLC kolonnidel (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr 164941), mõlemad olid täidetud 2 μm-ga.gradient 8%-lt 35%-ni ACN 60 minutiga, seejärel tõusis lineaarselt 98%-ni B 6 minutiga voolukiirusel 300 Nl/min.MS spektrid (350-1500 m/z) koguti eraldusvõimega 60 000, AGC 4 × 105 ja maksimaalse sisestusajaga 50 ms.Valitud ioonid fragmenteeriti järjestikku HCD-ga 3-sekundiliste tsüklitega normaliseeritud kokkupõrkeenergiaga 30%, kvadrupooli isolatsiooniaknaga 1,6 m/z ja eraldusvõimega 15000. 5 × 104 tandemmassispektromeetri AGC sihtmärk ja maksimaalne süstimisaeg kasutati 22 ms.Dünaamiliseks välistamiseks on seatud 45 sekundit. Määramata ioonid või need, mille laeng oli 1+ ja >7+, lükati MS/MS puhul tagasi. Määramata ioonid või need, mille laeng oli 1+ ja >7+, lükati MS/MS puhul tagasi. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määramata ioonid või ioonid laenguga 1+ ja >7+ lükati MS/MS puhul tagasi.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määratlemata ioonid või ioonid laengutega 1+ ja >7+ lükati MS/MS puhul tagasi.
Proovi ettevalmistamise etapid kuni NeutrAvidini helmeste rikastamiseni olid samad, mis ülalkirjeldatud LC-MS/MS analüüsis.Laadimiskontrolli sisendina kasutati ligikaudu 50 μg lüsaati ja klõpsreaktsioonide jaoks kasutati 2 mg lüsaati.Pärast rikastamist ja neutravidiiniga pesemist elueeriti seotud valgud, lisades agaroosvaigu helmestele 50 μl Laemmli puhvrit ja keetes 95 °C juures 5 minutit.Kontrollkoormuse sisendit ja helmestega rikastatud proove analüüsiti SDS-PAGE abil ja kanti standardsete Western blot meetoditega PVDF membraanidele (Millipore, #ISEQ00010).Membraanid blokeeriti 5% kooritud piimaga (Sangon, #A600669) TBS-is, mis sisaldas 0,1% Tween-20 (TBST), ja inkubeeriti järjestikku primaarsete ja sekundaarsete antikehadega.Primaarsed antikehad lahjendati 1:1000 5% lõssis TBST-s ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C.Sekundaarseid antikehi kasutati vahekorras 1:5000 ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril.Membraanid visualiseeriti kemoluminestsentsiga, kasutades Chemidoc MP pildistamissüsteemi.Kõik joonisel kujutatud blotide ja geelide lõikamata skaneeringud on esitatud algandmetena.
Selles uuringus kasutatud primaarsete antikehade hulka kuulusid küüliku anti-SFPQ monoklonaalne antikeha (CST, nr 71992), küüliku anti-FUS monoklonaalne antikeha (CST, nr 67840), küüliku anti-NSUN2 polüklonaalne antikeha (Proteintech, nr 20854-1-). AP), küüliku mSin3A-vastane polüklonaalne antikeha (Abcam, #ab3479), hiire märgisevastane monoklonaalne antikeha (TransGen, #HT201-02), hiire β-aktiinivastane monoklonaalne antikeha (TransGen, #HC201-01), küüliku vastane monoklonaalne antikeha - CDK2 monoklonaalne antikeha (ABclonal, #A0094), küüliku monoklonaalne antikeha CTBP1 vastu (ABclonal, #A11600), küüliku polüklonaalne antikeha DUT vastu (ABclonal, #A2901), küüliku polüklonaalne antikeha PSMC4 vastu (ABclonal, #A2 anti-05), #A2 anti-05 DNAJB1 polüklonaalne antikeha (ABclonal, # A5504).Neid antikehi kasutati 1:1000 lahjenduses 5% kooritud piimas TBST-s.Selles uuringus kasutatud sekundaarsed antikehad hõlmasid küülikuvastast IgG-d (TransGen, #HS101-01), hiirevastast IgG-d (TransGen, #HS201-01) lahjenduses 1:5000.
Edasiseks uurimiseks, kas BRD4 interakteerub SFPQ-ga, plaaditi HEK293T üleekspresseerivad stabiilsed HEK293T ja BRD4-miniSOG rakud 10 cm tassidesse.Rakke pesti külma PBS-ga ja lüüsiti 1 ml Pierce IP lüüsipuhvris (Thermo Fisher, #87787) koos EDTA-vaba proteaasi inhibiitoriga 30 minutit temperatuuril 4 °C.Pärast seda koguti lüsaadid 1,5 ml tsentrifuugituubidesse ja tsentrifuugiti 15 871 xg juures 10 minutit temperatuuril 4 °C.Supernatant koguti ja inkubeeriti 5 ug anti-V5 märgistatud hiire monoklonaalse antikehaga (CST, #80076) üleöö temperatuuril 4 °C.Peske ligikaudu 50 µl A/G valgu magnethelmeid (MCE, #HY-K0202) kaks korda PBS-iga, mis sisaldab 0,5% Tween-20.Seejärel inkubeeriti rakulüsaate magnethelmestega 4 tundi temperatuuril 4 °C, pöörates neid alt üles.Seejärel pesti helmeid neli korda 1 ml PBST puhvriga ja keedeti 95 °C juures 5 minutit.Proove analüüsiti SDS-PAGE geelidel ja kanti standardsete Western blot meetoditega PVDF membraanidele.Membraanid blokeeriti 5% kooritud piimas TBST-s ja inkubeeriti järjestikku primaarsete ja sekundaarsete antikehadega.Primaarne antikeha Küüliku anti-SFPQ monoklonaalset antikeha (CST, #71992) kasutati vahekorras 1:1000 5% kooritud piimas TBST-s ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C.Küülikuvastast IgG-d kasutati vahekorras 1:5000 ja inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril.Membraanid visualiseeriti kemoluminestsentsiga, kasutades Chemidoc MP pildistamissüsteemi.
Kõik lahustile juurdepääsetava pinnaala (SASA) analüüsiks kasutatud struktuurid saadi Protein Data Bankist (PDB)52 või AlphaFoldi valgustruktuuride andmebaasist53.FreeSASA programmi abil arvutati iga jäägi jaoks absoluutne SASA.Iga struktuuri keskmise SASA saamiseks kasutati ainult täielikke ja ühemõttelisi SASA andmeid märgistatud histidiini ja selle naabrite kohta.Iga histidiini suhteline lahusti juurdepääsetavus (RSA) arvutati, jagades absoluutse SASA väärtuse lahustile saadaoleva empiirilise maksimaalse võimaliku jäägi pindalaga.Seejärel klassifitseeriti kõik histidiinid peidetuks, kui keskmine RSA oli alla 20%, vastasel juhul eksponeeriti56.
DDA-režiimis saadud töötlemata faile otsiti Proteome Discovereri (v2.5) või MSfraggeri (Fragpipe v15.0) abil asjakohases SwissProti kontrollitud valguandmebaasis, mis sisaldas tavalisi saasteaineid.Peptiidid vajasid täielikku trüpsiini kahe puuduva lõhustamiskohaga, karbamoüülmetüülimist fikseeritud modifikatsioonina ja metioniini oksüdatsiooni dünaamilise modifikatsioonina.Prekursori ja fragmendi kaalutolerantsid määrati vastavalt 10 ppm ja 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Saasteainete tabamused eemaldati ja valgud filtreeriti, et saada valede avastamise määr <1%. Saasteainete tabamused eemaldati ja valgud filtreeriti, et saada valede avastamise määr <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфнифщих коэфнифулицо%. Saasteainete tabamused eemaldati ja valgud filtreeriti, et saada valede tuvastamise määr <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложниных1%. Saasteainete tabamused eemaldati ja valgud filtreeriti, et saada <1% valepositiivne määr.Kvantitatiivseks analüüsiks ilma märgiseid kasutamata kasutati kolme bioloogilise korduse normaliseeritud valgusisaldust.Valgu subtsellulaarse lokaliseerimise analüüs viidi läbi, kasutades Gene Ontology (GO) analüüsi firmast DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ja Alice Tingi rühma koostatud ja avaldatud andmebaase.Vulkaanikaart saadi firmalt Perseus (v1.6.15.0). Valkude arvukuse muutuste statistilist olulisust testiti kahepoolse t-testi abil ja valgu tabamused tuvastati arvukuse muutusega >2 (kui pole öeldud teisiti) ja p väärtusega <0,05. Valkude arvukuse muutuste statistilist olulisust testiti kahepoolse t-testi abil ja valgu tabamused tuvastati arvukuse muutusega >2 (kui pole öeldud teisiti) ja p väärtusega <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Valgusisalduse muutuste statistilist olulisust testiti kahepoolse t-testi abil ja valgu kokkulangevused tuvastati sisu muutusega >2 (kui pole teisiti märgitud) ja ap väärtusega <0,05.–– Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Valgusisalduse korduvate muutuste statistilist olulisust testiti kahepoolse t-testi abil ja valgu vasted määrati sisu muutuste korral >2 (kui pole teisiti märgitud) ja p-väärtuste <0,05 korral.Valkude interaktsiooni analüüs viidi läbi, kasutades GO analüüsi koos Stringi andmebaasiga.
Sarnaste tulemustega viidi läbi kolm bioloogilist kordust.Statistiline analüüs tehti GraphPad Prismiga (GraphPad tarkvara) ja vulkaanidiagrammid genereeriti Perseusega (v1.6.15.0).Kahe rühma võrdlemiseks määrati p-väärtused kahepoolse Studenti t-testi abil.Vulkaanidiagrammidesse lisati ainult katserühmas vähemalt kaks korda tuvastatud üksikud valgud ja kontrollrühma vastavad puuduvad väärtused asendati normaaljaotusest Perseusega, et saaks arvutada p-väärtust.Vearibad tähistavad keskmist ± standardhälvet.Statistilise analüüsi proteoomilistes analüüsides säilitati valkude arvukus, mis ilmnesid vähemalt kahes bioloogilises korduses.Statistilisi meetodeid valimi suuruse eelmääramiseks ei kasutatud.Katsed ei ole juhuslikud.Eksperimendi ja tulemuste hindamise ajal ei olnud teadlased ülesannete suhtes pimedad.
Lisateavet uuringu kavandamise kohta leiate selle artikliga seotud loodusuuringute aruande kokkuvõttest.
Selles uuringus saadud massispektromeetria andmed esitati ProteomeXchange konsortsiumile iProX57 partnerhoidla kaudu andmestiku ID PXD034811 all (PDPL-MS andmestik).Toorandmed esitatakse algandmefailide kujul.See artikkel sisaldab algandmeid.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naabruskonnaga tutvumine: lähedusest sõltuva biotinüülimise kasutamine valgukomplekside iseloomustamiseks ja organellide kaardistamiseks. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naabruskonnaga tutvumine: lähedusest sõltuva biotinüülimise kasutamine valgukomplekside iseloomustamiseks ja organellide kaardistamiseks.Gingras, AS, Abe, KT ja Raut, B. Ümbruskonna tundmine: lähedusest sõltuva biotinüülimise kasutamine valgukomplekside iseloomustamiseks ja organellide kaardistamiseks. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复征蛋白质复從義物 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naabruskonna mõistmine: kasutage naabruskonna sõltuvust bioloogilisest elust.Gingras, AS, Abe, KT ja Raut, B. Läheduse mõistmine: valgukomplekside iseloomustamine ja organellide kaardistamine, kasutades lähedusest sõltuvat biotinüülimist.Praegune.Minu arvamus.Keemiline.bioloogia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB jt.Mikrokeskkonna kaardistamine, kandes Dexteri energiat immuunrakkudesse.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Kahe proteoomi skaala võrgud tuvastavad inimese interaktoomi rakuspetsiifilist ümberkujundamist.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).