Uudised

Traditsioonilised nakkushaiguste tuvastamise diagnostilised strateegiad nõuavad lauainstrumentide kasutamist, mis ei sobi hoolduspunkti testimiseks (POCT).Arenev mikrofluidika on väga miniatuurne, automatiseeritud ja integreeritud tehnoloogia, mis on potentsiaalne alternatiiv traditsioonilistele meetoditele kiireks, odavaks ja täpseks kohapealseks diagnostikaks.Molekulaardiagnostika meetodeid kasutatakse mikrofluidilistes seadmetes laialdaselt kui kõige tõhusamaid meetodeid patogeenide tuvastamiseks.See ülevaade võtab kokku hiljutised edusammud nakkushaiguste mikrofluidipõhise molekulaardiagnostika vallas nii akadeemilisest kui ka tööstuslikust vaatenurgast.Esiteks kirjeldame tüüpilist nukleiinhapete töötlemist kiibil, sealhulgas proovide eeltöötlust, amplifikatsiooni ja signaali lugemist.Seejärel võrreldakse nelja tüüpi mikrofluidplatvormide omadusi, eeliseid ja puudusi.Järgmisena käsitleme digitaalsete analüüside kasutamist nukleiinhapete absoluutseks kvantifitseerimiseks.Nii klassikalised kui ka hiljutised kaubanduslikud mikrofluidipõhised molekulaardiagnostika seadmed on kokkuvõtlikud tõendid turu hetkeseisu kohta.Lõpuks pakume välja tulevased suunad nakkushaiguste mikrofluidiliseks diagnoosimiseks.
Nakkushaigusi põhjustavad patogeenid, sealhulgas bakterid, viirused ja parasiidid, mis on levinud kogu maailmas.Erinevalt teistest haigustest nakatuvad patogeenid kiiresti ning levivad inokuleerimise, õhu- ja veekeskkonna kaudu inimeste ja peremeesloomade vahel [1].Nakkushaiguste ennetamine on rahvatervise meetmena ülioluline.Kolm peamist strateegiat nakkushaiguste vastu võitlemiseks: (1) kontrollige nakkusallikat;(2) edastustee katkestus;(3) vastuvõtlike populatsioonide kaitse.Peamiste strateegiate hulgas peetakse nakkusallika kontrolli kõige olulisemaks strateegiaks selle mugavuse ja madala hinna tõttu.Nakatunud isikute kiire diagnoosimine, isoleerimine ja ravi on kriitilise tähtsusega ning nõuavad kiireid, tundlikke ja täpseid diagnostikastrateegiaid [2].Nakkushaiguste praegune diagnoos ühendab tavaliselt haigusnähtudel ja sümptomitel põhineva kliinilise läbivaatuse ning laboratoorsed uuringud, nagu rakukultuur ja molekulaardiagnostika, mis nõuavad koolitatud personali, töömahukaid protseduure ja kalleid testimisseadmeid [3, 4].Nakkushaiguste puhangute ennetamine nõuab kiiret, odavat ja täpset lokaalset diagnoosimist, eriti piiratud ressursiga piirkondades, kus nakkushaigused on tavalised ja rasked [5], samuti ravi kõrbes või lahinguväljal, kus hädaolukordi ei saa ette näha..arstiabi on piiratud [6].Selles kontekstis on mikrofluidika tehnoloogia, mis ühendab mikroelektromehaaniliste süsteemide tehnoloogiad, nanotehnoloogia või materjaliteaduse täpseks vedelikuga manipuleerimiseks [7,8,9,10], pakkudes uusi võimalusi hoolduspunkti tuvastamiseks (POCT).) nakkustekitajad väljaspool haiglaid ja laboreid.Võrreldes traditsioonilise aeganõudva diagnostikaga pakub mikrofluiditehnoloogia haiguspuhangute ajal molekulaardiagnostika proovide ja kulude kokkuhoidu.2019. aasta koroonaviirushaiguse (COVID-19) ülemaailmse leviku põhjuseks on raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2), mistõttu rõhutatakse taas mikrofluidika tähtsust pandeemia õigeaegseks ennetamiseks ja tõrjeks [11, 12 , 13].Erinevalt traditsioonilisest diagnostikast kasutab mikrofluidiline POCT proovivõtukoha lähedal testimiseks väikseid kaasaskantavaid seadmeid, alates lauaanalüsaatoritest kuni väikeste külgvoolu testribadeni [14].Nendel testidel on proovide ettevalmistamine lihtsustatud või üldse mitte, kiire signaali võimendamine ja tundlikud signaalinäidud, mille tulemuseks on lühike kestus ja täpsed tulemused mõne minuti jooksul.Mikrofluidipõhiste tervishoiuinstrumentide kättesaadavus ja masstootmine on laiendanud nende kulutõhusaid ja otseseid diagnostikarakendusi väljaspool haiglat, patsiendi läheduses ja isegi kodus.
Olemasolevate nakkushaiguste diagnoosimise strateegiate hulgas on molekulaardiagnostika üks tundlikumaid [15, 16].Lisaks kasutatakse COVID-19 pideva tuvastamise kuldstandardina sageli molekulaardiagnostikat, mis võimaldab RNA või DNA viirusspetsiifilisi piirkondi vahetult tuvastada enne immuunvastuse tekkimist [17, 18].Käesolevas ülevaates tutvustame nakkushaiguste mikrofluidikapõhiste molekulaardiagnostika protsesside uusimaid edusamme akadeemilisest vaatenurgast kuni tulevaste tööstuslike perspektiivideni (joonis 1).Alustame nukleiinhapete tuvastamise kolme põhietapiga: proovide eeltöötlus kiibil, nukleiinhapete võimendamine ja signaali lugemine.Seejärel võrdlesime erinevat tüüpi mikrofluidiplatvorme nende struktuuri ja funktsiooniga, näidates ainulaadseid omadusi (tugevused ja nõrkused).Digitaalset nukleiinhapete tuvastamist arutatakse edasi ja tuuakse näitena kolmanda põlvkonna tehnoloogiast nakkusohtlike patogeeni molekulide absoluutseks kvantifitseerimiseks.Lisaks esitletakse mitut tüüpilist ja uusimat kaubanduslikku POCT-seadet, et demonstreerida molekulaardiagnostika mikrofluidse POCT turu hetkeseisu.Samuti arutame ja selgitame oma nägemust tulevaste rakenduste jaoks.
Nukleiinhapete tuvastamiseks mõeldud mikrofluidkiipide moodulid võib vastavalt nende funktsioonidele jagada kolme kategooriasse (proovide võtmine, äratundmine ja signaalimine) [19].Nende moodulite hulgas teostab proovivõtumoodul peamiselt proovi lüüsi ja nukleiinhapete ekstraheerimist.Sensorimoodul juhib peamiselt nukleiinhappesignaalide muundamist ja võimendamist.Signalisatsioonimoodul tuvastab andurimooduli poolt teisendatud ja töödeldud signaali.Tuginedes kiibil olevate nukleiinhapete tuvastamise protsessile, võtame kokku erinevad kiibid, mis suudavad realiseerida sisend- ja väljundfunktsiooni.
Nukleiinhapete tuvastamise esimene etapp on nukleiinhappe ekstraheerimine, st sihtnukleiinhappe eraldamine algsest proovist.Nukleiinhapete ekstraheerimine toimub nukleiinhapete puhastamiseks teistest molekulaarsetest saasteainetest, nukleiinhappemolekulide esmase struktuuri terviklikkuse tagamiseks ja tulemuste optimeerimiseks.Nukleiinhapete ekstraheerimine nõuab vajalikku proovi lüüsi ja nukleiinhapete püüdmist, mille kvaliteedil ja efektiivsusel on tohutu mõju uurimis- ja diagnostikatulemustele.Ekstraheerimise ajal esinevad peened kõrvalmõjud võivad edasist tuvastamist piirata.Näiteks inhibeerivad polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ja lingu isotermilise amplifikatsiooni (LAMP) meetodeid mõned nukleiinhappe eraldamise reagentides olevad orgaanilised lahustid, nagu etanool ja isopropanool [20].Vedelik-vedelik ekstraheerimine ja tahkefaasiline ekstraheerimine on kõige populaarsemad meetodid nukleiinhapete eraldamiseks [21], kuid vedelik-vedelik ekstraheerimine kiibil on äärmiselt piiratud, kuna vedelik-vedelik ekstraheerimisel kasutatavad reaktiivid põhjustavad enamiku mikrofluidkiipide korrosiooni. .Siin tõstame esile mikrokiibipõhised tahkefaasilised ekstraheerimismeetodid ning võrdleme nende eeliseid ja puudusi.
Räni on oma biosobivuse, stabiilsuse ja modifitseerimise lihtsuse tõttu substraatmaterjal, mis ühildub nukleiinhapetega [22].Oluline on see, et ränidioksiidi või muude materjalidega modifitseerimisel on sellel komposiidil omadused adsorbeerida negatiivselt laetud nukleiinhappeid madala pH ja kõrge soolasisaldusega tingimustes, elueerides samal ajal kõrge pH ja madala soolasisaldusega lahustega.Selle nähtuse põhjal on võimalik nukleiinhapet puhastada.
Nukleiinhapete ekstraheerimiseks mikrofluidikas on kasutatud mitmesuguseid ränidioksiidipõhiste materjalide vorme, nagu ränidioksiidi helmed, pulbrid, mikrokiudfiltrid ja ränidioksiidi membraanid [23, 24, 25, 26].Olenevalt materjali omadustest saab ränipõhiseid materjale mikroskeemides kasutada erineval viisil.Näiteks saab ränidioksiidi graanuleid, pulbreid ja kaubanduslikke nanofiltreid lihtsalt asetada mikrofluidkiipide pooridesse või mikrokanalitesse ja need aitavad proovidest nukleiinhappeid ekstraheerida [27, 28, 29].Pindmodifitseeritud ränidioksiidi membraane saab kasutada ka DNA kiireks puhastamiseks patogeenidest madala hinnaga.Näiteks Wang et al.[30] Kombineerides denatureerivad amplifikatsioonireaktsioonid vesiikulite vahendatud ahelavahetusega kitosaani oligosahhariididega kaetud ränidioksiidi membraanidega, võeti kasutusele mitmekülgne kaasaskantav süsteem, mis tuvastas edukalt 102–108 kolooniat moodustavat üksust.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus.ja viiruse olemasolu oli kergesti nähtav.Powell et al.[31] Seejärel kasutati C-hepatiidi viiruse (HCV), inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV), Zika viiruse ja inimese papilloomiviiruse tuvastamiseks ning automaatseks paljundamiseks ränipõhiseid mikrokiipe, mille käigus töötati välja RNA viiruste püüdmiseks 1,3 μl käänuline mikroreaktor.ja teostada in situ võimendust.Lisaks nendele meetoditele mängivad nukleiinhapete ekstraheerimisel võtmerolli ka pinnaga modifitseeritud ränidioksiidi mikrokolonnid, kuna modifitseeriva materjali geomeetria ja omadused suurendavad oluliselt ekstraheerimise efektiivsust.Chen et al.[32] pakkus välja mikrofluidse platvormi madala kontsentratsiooniga RNA eraldamiseks, mis põhineb aminokattega räni mikrokolonnidel.See mikrofluidiseade integreerib ränisubstraadile 0,25 cm2 mikrosambaid, et saavutada suurem ekstraheerimistõhusus tänu suure pinna ja mahu suhte konstruktsioonile.Selle konstruktsiooni eeliseks on see, et mikrofluidseadmega on võimalik saavutada kuni 95% nukleiinhapete ekstraheerimise efektiivsust.Need ränipõhised strateegiad näitavad nukleiinhapete kiire isoleerimise väärtust madala hinnaga.Koos mikrofluidkiipidega ei saa ränipõhised ekstraheerimisstrateegiad mitte ainult suurendada nukleiinhapete tuvastamise tõhusust, vaid hõlbustada ka analüütiliste seadmete miniaturiseerimist ja integreerimist [20].
Magneteraldusmeetodid kasutavad magnetosakesi nukleiinhapete eraldamiseks välise magnetvälja juuresolekul.Tavaliselt kasutatavad magnetosakesed hõlmavad Fe3O4 või y-Fe2O3 magnetosakesi, mis on kaetud ränidioksiidi, amino- ja karboksüülrühmaga [33,34,35,36].Magnetosakeste eristav omadus võrreldes ränipõhiste SPE meetoditega on välismagnetitega manipuleerimise ja juhtimise lihtsus.
Nukleiinhapete ja ränidioksiidi vahelist elektrostaatilist interaktsiooni kasutades adsorbeeritakse kõrge soola ja madala pH tingimustes nukleiinhapped ränidioksiidiga kaetud magnetosakeste pinnale, samas kui madala soola ja kõrge pH tingimustes saab molekule pesta. uuesti..Ränidiga kaetud magnethelmed võimaldavad eraldada DNA-d suurtest proovidest (400 μL), kasutades magnetiliselt juhitavat liikumist [37].Demonstratsiooniks Rodriguez-Mateos jt.[38] kasutas häälestatavaid magneteid, et juhtida magnethelmeste ülekandmist erinevatesse kambritesse.Ränidiga kaetud magnetosakeste põhjal saab reoveeproovidest eraldada 470 koopiat/ml SARS-CoV-2 genoomset RNA-d LAMP pöördtranskriptsiooni tuvastamiseks (RT-LAMP) ja vastuse saab lugeda 1 tunni jooksul.palja silmaga (joonis 2a).
Magnetilistel ja poorsetel materjalidel põhinevad seadmed.SARS-CoV-2 RNA tuvastamiseks mõeldud mikrofluidiseadme IFAST RT-LAMP kontseptuaalne diagramm (kohandatud [38]).b Tsentrifugaalne mikroseade bukaalse tampooni nukleiinhappe dSPE jaoks (kohandatud [39]).c Sisseehitatud omatoitega proovikontsentraator, mis kasutab FTA®-kaarti (kohandatud [50]).d Kitosaaniga modifitseeritud Fusion 5 filterpaber (kohandatud [51]).SARS-CoV-2 raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2, RT-LAMP pöördtranskriptsiooni ahela vahendatud isotermiline amplifikatsioon, FTA leidjate tehnoloogiapartnerid, NA nukleiinhape
Positiivselt laetud magnetosakesed sobivad ideaalselt nukleiinhappe fosfaatkarkassi kinnitamiseks.Teatud soolakontsentratsiooni korral võivad nukleiinhapete negatiivselt laetud fosfaatrühmad olla positiivselt laetud magnetiliste komposiitosakeste pinnal.Seetõttu töötati nukleiinhapete ekstraheerimiseks välja kareda pinnaga ja suure aminorühmade tihedusega magnetilised nanoosakesed.Pärast magnetilist eraldamist ja blokeerimist saab magnetilisi nanoosakesi ja DNA komplekse otse PCR-is kasutada, mis välistab vajaduse keerukate ja aeganõudvate puhastamis- ja elueerimisoperatsioonide järele [35].Negatiivsete karboksüülrühmadega kaetud magnetilisi nanoosakesi on kasutatud ka kõrge kontsentratsiooniga polüetüleenglükooli ja naatriumkloriidi lahustes pindadele adsorbeerunud nukleiinhapete eraldamiseks [36].Nende pinnaga modifitseeritud magnethelmestega ühildub DNA ekstraheerimine järgneva amplifikatsiooniga.Dignan et al.[39] kirjeldas automatiseeritud ja kaasaskantavat tsentrifugaalset mikrofluidiplatvormi nukleiinhapete eeltöötluseks, mis võimaldab mittetehnilistel töötajatel seda kohapeal kasutada.Lisaks näitab eraldatud DNA kokkusobivus LAMP-iga, mis on hästi sobiv nukleiinhapete analüüsimiseks hooldepunktis, täiendavalt minimaalseid seadmenõudeid ja sobivust kolorimeetrilisteks analüüsideks (joonis 2b).
Magnethelmeste meetodid pakuvad automaatse ekstraheerimise võimalust, millest mõned on olemas kaubanduslikes automatiseeritud nukleiinhapete ekstraktorites [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Hiina) ja Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Magnethelmeste ja mikrofluidika kombineerimise eeliseid saab kasutada nukleiinhapete tõhusaks automatiseeritud ekstraheerimiseks, mis võib potentsiaalselt edendada molekulaardiagnostika arengut;magnethelmeste kombinatsioon mikrofluidikaga sõltub siiski suuresti keerukatest juhtimissüsteemidest magnethelmeste täpseks manipuleerimiseks, mis seletab kaubanduslike toodete populaarsust, kuna need on mahukad ja kallid, mis piirab magnethelmeste edasist kasutamist POCT-s.
Nukleiinhapete tuvastamiseks on kasutatud ka mitmeid poorseid materjale, nagu modifitseeritud nitrotselluloosfiltrid, Finders Technology Associatesi (FTA) kaardid, polüeetersulfoonil põhinevad filterpaberid ja glükaaniga kaetud materjalid [40, 41, 42, 43, 44].Poorseid kiulisi materjale, nagu kiudpaberit, kasutati esmakordselt DNA isoleerimiseks pikaahelaliste DNA molekulide füüsiliselt kiududega põimimise teel.Väikesed poorid põhjustavad DNA molekulide tugevat füüsilist piiramist, mis mõjutab positiivselt DNA ekstraheerimist.Kiudpaberi erineva poorisuuruse tõttu ei suuda ekstraheerimise efektiivsus rahuldada DNA amplifikatsiooni vajadusi [45, 46].FTA-kaart on kaubanduslik filterpaber, mida kasutatakse kohtuekspertiisi valdkonnas ja mida kasutatakse laialdaselt teistes molekulaardiagnostika valdkondades.Kasutades proovis olevate rakumembraanide lüüsimiseks erinevate kemikaalidega immutatud tselluloosist filterpaberit, on vabanenud DNA kaitstud lagunemise eest kuni 2 aastat.Hiljuti töötati välja immutatud tselluloospaber erinevate patogeenide, sealhulgas SARS-CoV-2, leishmaniaasi ja malaaria molekulaarseks tuvastamiseks [47, 48, 49].HIV isoleeritud plasmas lüüsitakse otse ja viiruse nukleiinhapet rikastatakse kontsentraatorisse ehitatud FTA® voolumembraanis, mis võimaldab nukleiinhapet tõhusalt toota [50] (joonis 2c).Peamine probleem FTA-kaartide abil nukleiinhapete tuvastamisel on see, et sellised kemikaalid nagu guanidiin ja isopropanool pärsivad järgnevaid amplifikatsioonireaktsioone.Selle probleemi lahendamiseks töötasime välja Fusion 5 kitosaaniga modifitseeritud filterpaberi, mis ühendab endas nii DNA molekulide ja kiulise filterpaberi füüsilise põimimise kui DNA elektrostaatilise adsorptsiooni eelised kitosaaniga modifitseeritud ühenditele, et saavutada ülitõhus nukleiinhapete ekstraheerimine. ..filtrikiud [51] (joonis 2d).Samamoodi on Zhu et al.[52] demonstreerisid Zika viiruse RNA kiireks eraldamiseks ja tuvastamiseks kitosaaniga modifitseeritud PCR-meetodit, mis põhineb in situ kapillaaride mikrofluidsüsteemil.Nukleiinhappeid saab adsorbeerida/desorbeerida vastavalt segalüsaadi/PCR söötmes, lähtudes kitosaani sisse/välja lülitusomadusest.sisse ja välja”, reageerib pH-le.
Nagu eespool mainitud, ühendavad need strateegiad erinevate tahke faasi materjalide eelised ja suurendavad nukleiinhapete ekstraheerimise efektiivsust mikrofluidikas.Praktilistes rakendustes on nende materjalide kasutamine suurtes kogustes ebaökonoomne ning tavaliste materjalide õige pinnatöötlus või pinna muutmine nende materjalidega võib samuti säilitada nende funktsiooni.Seetõttu arvatakse, et nende strateegiate rakendamine pärast pilootuuringut võib kulusid vähendada.
Nukleiinhapete testimisel mikrofluidplatvormidel kasutatakse sageli väikeseid proovimahtusid (< 100 µl), mistõttu on vaja sihtnukleiinhappeid amplifitseerida spetsiifiliste sondidega, et need muundataks signaaliks, mis on mugav allavoolu tuvastamiseks (optiline, elektriline ja magnetiline) [53, 54]. Nukleiinhapete testimisel mikrofluidplatvormidel kasutatakse sageli väikeseid proovimahtusid (< 100 µl), mistõttu on vaja sihtnukleiinhappeid amplifitseerida spetsiifiliste sondidega, et need muundataks signaaliks, mis on mugav allavoolu tuvastamiseks (optiline, elektriline ja magnetiline) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Nukleiinhapete testimisel mikrofluidplatvormidel kasutatakse sageli väikeseid proovimahtusid (<100 µL), mistõttu on vaja sihtnukleiinhappeid amplifitseerida spetsiaalsete sondide abil, et muuta see signaaliks, mis on mugav järgnevaks tuvastamiseks (optiline, elektriline ja magnetiline). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 小样本量 （（<100 µl） ， ， 因此 使用 特定 探针 扩增 目标 目标 ， ， ， 转换 转换 便于 下游 检测 （（（（（光学 光学 电学 电学）））） 信号 信号 信号 信号 信号）））））） 电学 电学 电学 电学 电学 电学 电学））））））））））. ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 小样本量 小样本量 （（（<100 µl） ， ， 因此 特定 探针 扩增 ， ， 以 转换 为 下游 下游 （（（（电学 磁学 磁学） 的 信号 信号 [53, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54, 54. ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Nukleiinhapete tuvastamiseks mikrofluidplatvormidel kasutatakse tavaliselt väikeseid proovimahtusid (<100 μl), mis nõuab sihtnukleiinhapete amplifitseerimist spetsiaalsete sondide abil, et muuta need signaalideks järgnevaks tuvastamiseks (optiline, elektriline ja magnetiline) [53, 54]] .Nukleiinhapete võimendamine mikrofluidikas võib samuti kiirendada reaktsioone, optimeerida avastamispiire, vähendada proovide nõudeid ja parandada tuvastamise täpsust [55, 56].Viimastel aastatel on kiire ja täpse tuvastamise realiseerimisega mikrofluidikas rakendatud erinevaid nukleiinhapete amplifikatsiooni meetodeid, sealhulgas PCR ja mõned isotermilised amplifikatsioonireaktsioonid.Selles jaotises võetakse kokku mikrofluidsüsteemidel põhinevad nukleiinhapete tuvastamise meetodid.
PCR on organismi DNA replikatsiooniprotsessi simulatsioon, mille teooriat on üksikasjalikult kirjeldatud mujal ja sellest siinkohal juttu ei tule.PCR võib amplifitseerida väga väikest kogust sihtmärk-DNA/RNA-d eksponentsiaalse kiirusega, muutes PCR-i võimsaks vahendiks nukleiinhapete kiireks tuvastamiseks.Viimastel aastakümnetel on hoolduspunkti diagnostika vajaduste rahuldamiseks välja töötatud palju kaasaskantavaid mikrofluidiseadmeid, mis on varustatud PCR termotsüklisüsteemidega [57, 58].Kiibipõhise PCR-i saab vastavalt erinevatele temperatuuri reguleerimismeetoditele jagada nelja tüüpi (tavaline, pidevvooluline, ruumiliselt lülitatav ja konvektiivne PCR) [59].Näiteks Gee et al.[60] töötasid oma mikrofluidiplatvormil välja otsese pöördtranskriptsiooni kvantitatiivse PCR (RT-qPCR) meetodi SARS-CoV-2, A- ja B-gripiviiruste multipleksseks tuvastamiseks kurgu tampooniproovides (joonis 3a).Park jt.[61] ehitas lihtsa patogeeni analüüsi kiibi, integreerides õhukese kilega PCR, elektroodid ja sõrmega juhitava polüdimetüülsiloksaanil põhineva mikrofluidimooduli.Mõlemad teosed kehastavad aga tavapärase PCR-i ühiseid puudusi.PCR nõuab termilist tsüklit, mis piirab seadme edasist miniatuursust ja lühendab testimisaega.
Pideval voolul põhineva mikrofluidilise ja ruumilülitusega PCR väljatöötamine on selle probleemi lahendamiseks ülioluline.Kasutades pikka serpentiinkanalit või lühikest sirget kanalit, võib pidevvoolu PCR tagada kiire võimenduse, tsirkuleerides reaktiive aktiivselt kolmes eelkuumutustsoonis koos kiibivälise pumbaga.See operatsioon väldib edukalt üleminekufaasi erinevate reaktsioonitemperatuuride vahel ja vähendab seega oluliselt testimisaega [62] (joonis 3b).Teises Jungi jt uuringus.[63] pakkus välja uue pöörleva PCR-i geneetilise analüsaatori, mis ühendab fikseeritud ja voolava PCR-i omadused ülikiire ja multipleksse pöördtranskriptsiooni PCR jaoks (joonis 3c).Nukleiinhapete amplifitseerimiseks pööratakse PCR-i mikrokiipi läbi kolme kuumutusploki erinevatel temperatuuridel: 1. denatureerimisplokk 94 °C, 2. anniilimisplokk temperatuuril 58 °C, 3. paisutusplokk temperatuuril 72 °C.
PCR rakendamine mikrofluidikas.dirRT-qPCR skemaatiline esitus mikrofluidiplatvormil (kohandatud [60]).b Serpentiinkanalil põhineva pideva voolu PCR mikrokiibi skemaatiline esitus (kohandatud [62]).c Pöörleva PCR-i geneetilise analüsaatori skemaatiline kujutis, mis koosneb mikrokiibist, kolmest soojendusplokist ja samm-mootorist (kohandatud [63]).d Termokonvektsiooni PCR skeem koos tsentrifuugimise ja seadistamisega (kohandatud [64]).DirRT-qPCR, otsene kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon
Kapillaare ja silmuseid või isegi õhukesi plaate kasutades saab konvektsioon-PCR kiiresti amplifitseerida nukleiinhappeid loomuliku vaba termilise konvektsiooni abil, ilma et oleks vaja välist pumpa.Näiteks töötati välja tsükliline olefiinpolümeeri mikrofluidiline platvorm valmistatud pöörleval kuumutusastmel, mis kasutab termilist tsüklit koos tsentrifuugimisega PCR ahela mikrokanalis [64] (joonis 3d).Reaktsioonilahust juhib termiline konvektsioon, mis vahetab rõngakujulise struktuuriga mikrokanalis pidevalt kõrget ja madalat temperatuuri.Kogu võimendusprotsessi saab lõpule viia 10 minutiga tuvastamispiiriga 70,5 pg/kanali kohta.
Nagu oodatud, on kiire PCR võimas tööriist täielikult integreeritud proovi-vastuse molekulaardiagnostika ja multipleksanalüüsi süsteemide jaoks.Kiire PCR vähendab oluliselt SARS-CoV-2 tuvastamiseks kuluvat aega, mis aitab kaasa COVID-19 pandeemia tõhusale kontrollile.
PCR nõuab keerulist termotsüklerit, mis POCT jaoks ei sobi.Hiljuti on mikrofluidika puhul rakendatud isotermilise amplifikatsiooni tehnikaid, sealhulgas, kuid mitte ainult, LAMP, rekombinaasi polümeraasi amplifikatsioon (RPA) ja nukleiinhappejärjestustel põhinev amplifikatsioon [65,66,67,68].Nende meetodite abil amplifitseeritakse nukleiinhappeid konstantsel temperatuuril, mis hõlbustab odavate, ülitundlike kaasaskantavate POCT-seadmete loomist molekulaardiagnostika jaoks.
Suure läbilaskevõimega mikrofluidikapõhised LAMP-analüüsid võimaldavad nakkushaigusi mitmekordselt tuvastada [42, 69, 70, 71].Koos tsentrifugaalse mikrofluidsüsteemiga võib LAMP veelgi hõlbustada nukleiinhapete tuvastamise automatiseerimist [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip töötati välja mitme paralleelse bakteri visuaalseks tuvastamiseks, kasutades LAMP-i [76] (joonis 4a).Kui kasutati testis optimeeritud LAMP-i, oli fluorestsentsi signaali-müra suhe ligikaudu 5-kordne ja tuvastamispiir ulatus genoomse DNA 7,2 koopiani μl kohta. Lisaks visualiseeriti meetodi alusel < 60 minutiga viie tavalise seedetrakti bakteriaalse patogeeni, sealhulgas Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ja Vibrio parahaemolyticus, olemasolu. Lisaks visualiseeriti meetodi alusel < 60 minutiga viie tavalise seedetrakti bakteriaalse patogeeni, sealhulgas Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ja Vibrio parahaemolyticus, olemasolu.Lisaks visualiseeriti selle meetodi abil vähem kui 60 minutiga viie tavalise bakteriaalse patogeeni olemasolu seedetraktis, sealhulgas Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ja Vibrio parahaemolyticus.此外 ， 基于 方法 在 在 <60 分钟 内 可 视化 视化 了 五 五 种 常见 细菌病 原体 的 ， ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 大 大 肠杆菌 肠杆菌 、 、 沙门 氏 氏 菌 菌 、 、 河流 河流 和 副溶血性 副溶血性。。。此外 ， 基于 方法 在 在 <60 分钟 内 视化 了 了 五 种 常见 消化道 细菌病 ， ， ， 包括 芽孢杆菌 、 大 、 肠 肠 氏 氏 氏 菌 弧菌 弧菌 和 和 副溶血 副溶血 性 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPLisaks visualiseeriti selle meetodi abil vähem kui 60 minutiga viie tavalise bakteriaalse seedetrakti patogeeni, sealhulgas Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius ja Vibrio parahaemolyticus, olemasolu.
LAMP-i eelised mikrofluidikas hõlmavad muu hulgas kiiret reageerimist ja miniatuurset tuvastamist.Kuid reaktsioonitemperatuuri (umbes 70 °C) tõttu tekivad LAMP-i ajal paratamatult aerosoolid, mille tulemuseks on kõrge valepositiivsete määr.LAMP jaoks tuleb optimeerida ka analüüsi spetsiifilisus, praimeri disain ja temperatuuri kontroll.Lisaks on kiibi konstruktsioonid, mis rakendavad ühel kiibil mitut sihtmärki, väga väärtuslikud ja neid tuleks arendada.Lisaks sobib LAMP ühte kiibi integreerituna mitmeotstarbeliseks tuvastamiseks, millel on suur tähtsus, kuid arenguruumi on veel palju.
LAMP kõrget valepositiivsuse määra saab osaliselt vähendada RPA-ga, kuna suhteliselt madal reaktsioonitemperatuur (~37 °C) põhjustab suhteliselt vähe aurustumisprobleeme [77].RPA süsteemis käivitavad kaks vastandlikku praimerit DNA sünteesi, seondudes rekombinaasiga ja amplifikatsiooni saab lõpule viia 10 minuti jooksul [78, 79, 80, 81].Seetõttu on kogu RPA protsess palju kiirem kui PCR või LAMP.Viimastel aastatel on mikrofluiditehnoloogia veelgi parandanud RPA kiirust ja täpsust [82,83,84].Näiteks Liu et al.[85] töötas välja mikrofluidilise integreeritud lateraalvoolu polümeraasi rekombinaasi amplifikatsioonitesti SARS-CoV-2 kiireks ja tundlikuks tuvastamiseks, integreerides pöördtranskriptsiooni RPA (RT-RPA) ja universaalse külgvoolu testribade tuvastamise süsteemi.ühtseks mikrofluidisüsteemiks.Joonis 4b).Avastamise piir on 1 koopia/µl või 30 koopiat proovi kohta ja tuvastamise saab lõpule viia umbes 30 minutiga.Kong et al.on välja töötanud kantava mikrofluidiseadme.[86] kasutas kehatemperatuuri ja mobiiltelefonipõhist fluorestsentsi tuvastamise süsteemi, et RPA abil kiiresti ja vahetult tuvastada HIV-1 DNA (joonis 4c).Kantav RPA test tuvastab 24 minuti jooksul sihtjärjestuse 100 koopiat/ml, mis näitab suurt potentsiaali HIV-1-ga nakatunud imikute kiireks diagnoosimiseks piiratud ressurssidega tingimustes.
Isotermiline võimendus hoolduspunkti testimisel (POCT).Spinni ja reaktsiooni SlipChip arendamine ja tootmine.Pärast plasmakeevitamist ühendati ülemine ja alumine laast mutrite komplektiga, et moodustada lõplik kiip (kohandatud [76]).b MI-IF-RPA süsteemi skeem COVID-19 tuvastamiseks (kohandatud alates [85]).c Kantava RPA testi skeem HIV-1 DNA kiireks tuvastamiseks (kohandatud [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksüfluorestseiin, inimese immuunpuudulikkuse viirus HIV, RPA rekombinaasi polümeraasi amplifikatsioon, LED valgusdiood, MI-IF-RPA integreeritud La Microfluidics Pomerase Pomerase-Flowly Võimendamine
Mikrofluidipõhine RPA areneb kiiresti, kuid kiibi valmistamise kulud ja reaktsioonikulu on liiga kõrged ning neid tuleb selle tehnoloogia kättesaadavuse suurendamiseks vähendada.Lisaks võib RPA kõrge tundlikkus mõjutada mittespetsiifiliste toodete võimendamist, eriti saastumise korral.Need piirangud võivad mõjutada RPA rakendamist mikrofluidsüsteemides ja väärivad täiendavat optimeerimist.RPA-põhiste mikrofluidistrateegiate teostatavuse parandamiseks POCT-s on vaja ka hästi kavandatud praimereid ja sonde erinevate sihtmärkide jaoks.
Cas13-l ja Cas12a-l on võime nukleiinhappeid juhuslikult lõhustada ja seega saab neid välja töötada tuvastamis- ja diagnostikavahenditena.Cas13 ja Cas12a aktiveeritakse seondumisel vastavalt sihtmärk-DNA või RNA-ga.Pärast aktiveerimist hakkab valk lõikama teisi lähedalasuvaid nukleiinhappeid, misjärel võivad patogeenspetsiifilisi nukleiinhappeid sihtivad juht-RNA-d lõhustada kustutatud fluorestsentssonde ja vabastada fluorestsentsi.Sellele teooriale tuginedes on Kellner et al.[87] töötasid välja Cas13-põhise meetodi [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] ja Broughton et al.[88] töötasid välja teise lähenemisviisi, mis põhineb Cas12a-l [CRISPR Trans Reporter, mis on suunatud DNA endonukleaasile (DTECR)].
Viimastel aastatel on CRISPR-il põhinevate nukleiinhapete tuvastamiseks ilmunud mitmesuguseid meetodeid [89, 90].Tavalised CRISPR-il põhinevad meetodid on sageli aeganõudvad ja töömahukad mitmete protseduuride, sealhulgas nukleiinhapete ekstraheerimise, amplifikatsiooni ja CRISPR-i tuvastamise tõttu.Vedelike kokkupuude õhuga võib suurendada valepositiivsete tulemuste tõenäosust.Eespool öeldut arvestades vajavad CRISPR-põhised süsteemid hädasti optimeerimist.
CRISPR-Cas12a ja CRISPR-Cas13a tuvastamisrakenduste jaoks on välja töötatud pneumaatiliselt juhitav mikrofluidiplatvorm, mis suudab paralleelselt teha 24 analüüsi [91].Süsteem on varustatud fluorestsentsi tuvastamise seadmega, mis läheb mööda nukleiinhappe amplifikatsioonist ja tuvastab automaatselt femtomolaarse DNA ja RNA proovid.Chen et al.[92] integreeritud rekombinaasi amplifikatsioon CRISPR-Cas12a süsteemiga tsentrifugaalses mikrofluidikas (joonis 5a).See töö ületab nende kahe protsessi integreerimise raskused, kuna Cas12a võib seedida messenger-DNA-d ja pärssida amplifikatsiooniprotsessi.Lisaks Chen et al.[92] lisaks eelsalvestasid reaktsioonireagendid tsentrifugaalsesse mikrofluidikontrolli, et kogu protsess automaatselt lõpule viia.Teises töös on Silva jt.[93] töötasid välja diagnostikameetodi ilma CRISPR/Cas12a võimenduseta ja nutitelefoni SARS-CoV-2 tuvastamiseks (joonis 5b).See analüüs, mida nimetatakse mobiiltelefonipõhiseks amplifikatsioonivabaks süsteemiks, sisaldab CRISPR/Cas-sõltuvat ensüümi, mis põhineb mikrofluidilistes kanalites katalaasi tekitatud mullide signaalide nutitelefoni visualiseerimisel.Tundlik tuvastamine alla 50 koopia/µl nukleiinhappe ilma eelamplifikatsioonita, kogu protsess proovi süstimisest signaali lugemiseni võtab aega vaid 71 minutit.
CRISPR-il põhinevad nukleiinhapete tuvastamise meetodid.Tsentrifugaalne POCT integreeritud molekulaardiagnostika jaoks, mis põhineb CRISPR-il (kohandatud [92]).b CASCADE-testi väljatöötamine SARS-CoV-2 nutitelefonipõhiseks analüüsiks (kohandatud [93]).RAA rekombinaasi amplifikatsioon, PAM-iga külgnev protospaceri motiiv, CRISPR-i rühmitatud lühikesed palindroomsed kordused regulaarsete intervallidega, CASCADE-süsteem ilma mobiiltelefoni võimenduseta CRISPR/CAS-sõltuvate ensüümidega, 1-etüül-3-[3-dimetüülaminopropüül]karbodiimiidvesinikkloriid EDC
Nukleiinhapete tuvastamise viimase etapina peegeldab signaali tuvastamine otseselt diagnostilisi tulemusi ja on kriitilise tähtsusega tegur tõhusa, tundliku ja täpse POCT väljatöötamisel.Signaale saab lugeda erinevate meetoditega, nagu fluorestsents-, elektrokeemiline, kolorimeetriline ja magnetiline strateegia.Selles jaotises kirjeldame iga lähenemisviisi põhjendust ja võrdleme nakkushaiguste molekulaardiagnostikat mikrofluidikas.
Fluorestsentsipõhiseid strateegiaid kasutatakse laialdaselt nakkushaiguste POCT-diagnostikas, kuna neil on suurepärane tundlikkus, madal hind, kasutuslihtsus ja hoolduspunktide analüüs [94, 95].Need strateegiad kasutavad tuvastatava signaali loomiseks märgistatud fluorofoore, nagu fluorestseeruvad värvained ja nanomaterjalid (fluorestsentsi võimendamine või kustutamine).See leid viitab sellele, et fluorestsentsipõhised strateegiad võib jagada otseseks fluorestsentsmärgistamiseks, sisse- ja väljalülitatud fluorestsentsi tuvastamiseks [96].Otsene fluorestsentsmärgise tuvastamine kasutab spetsiaalseid fluorestseeruvaid märgiseid, et märgistada spetsiifilisi ligandeid, mis tekitavad sihtmärgiga selektiivselt seondudes kindla koguse fluorestsentsi.Signaalipõhise fluorestsentsi tuvastamise korral on fluorestsentssignaali kvaliteet positiivselt seotud huvipakkuva suurusega.Fluorestsentsi intensiivsus on sihtmärgi puudumisel tühine ja on tuvastatav piisava sihtmärgi olemasolu korral.Seevastu "signaali väljalülitamise" fluorestsentsi abil tuvastatud fluorestsentsi intensiivsus on pöördvõrdeline sihtmärgi kogusega, saavutades algselt maksimaalse väärtuse ja vähenedes järk-järgult sihtmärgi suurendamisel.Näiteks kasutades CRISPR-Cas13a sihtmärgist sõltuvat trans-lõhustamismehhanismi, Tian et al.[97] töötasid välja uudse äratundmisstrateegia RNA-de tuvastamiseks, mis mööduvad otse pöördtranskriptsioonist (joonis 6a).Komplementaarsete siht-RNA-dega seondumisel saab CRISPR-Cas13-RNA kompleksi aktiveerida, käivitades mittespetsiifiliste reporter-RNA-de poolt transkollateraalse lõhustamise.Fluorestseeruvalt märgistatud reporter [fluorofoor (F)] kustutatakse kustutaja (Q) poolt puutumata ja fluorestseerub, kui aktiveeritud kompleks lõhustab.
Elektrokeemilise tuvastamise eeliseks on suur tuvastamise kiirus, lihtne tootmine, madal hind, lihtne kaasas kanda ja automaatjuhtimine.See on võimas analüütiline meetod POCT-rakenduste jaoks.Grafeeni väljatransistoride põhjal Gao et al.[98] töötasid välja nanobiosensori Borrelia burgdorferi bakterite Lyme'i tõve antigeenide multipleksseks tuvastamiseks tuvastamispiiriga 2 pg/ml (joonis 6b).
POCT-rakendustes on kasutatud kolorimeetrilisi analüüse, mis saavad kasu kaasaskantavuse, madala hinna, valmistamise lihtsuse ja visuaalse lugemise eelistest.Kolorimeetriline tuvastamine võib kasutada peroksidaasi või peroksidaasitaoliste nanomaterjalide oksüdeerimist, nanomaterjalide agregeerimist ja indikaatorvärvide lisamist, et muuta sihtnukleiinhapete olemasolu teave nähtavateks värvimuutusteks [99, 100, 101].Eelkõige kasutatakse kulla nanoosakesi laialdaselt kolorimeetriliste strateegiate väljatöötamisel ning tänu nende võimele kutsuda esile kiireid ja olulisi värvimuutusi, suureneb huvi POCT kolorimeetriliste platvormide väljatöötamise vastu nakkushaiguste in situ diagnoosimiseks [102].Integreeritud tsentrifugaalse mikrofluidiseadmega [103] saab saastunud piimaproovides toidupatogeene automaatselt tuvastada 10 bakteriraku tasemel ning tulemusi saab visuaalselt lugeda 65 minuti jooksul (joonis 6c).
Magnetsensori tehnikad suudavad magnetiliste materjalide abil analüüte täpselt tuvastada ja viimastel aastakümnetel on POCT rakenduste vastu olnud märkimisväärne huvi.Magnetanduri tehnikatel on mõned ainulaadsed eelised, näiteks odavad magnetmaterjalid, mitte kallid optilised komponendid.Magnetvälja kasutamine parandab aga tuvastamise efektiivsust ja vähendab proovi ettevalmistamise aega [104].Lisaks näitavad magnetsondeerimise tulemused bioloogiliste proovide ebaolulise magnetilise taustsignaali tõttu suurt spetsiifilisust, tundlikkust ja kõrget signaali-müra suhet [105].Sharma et al.integreeris magnettunneli ristmikul põhineva biosensori kaasaskantavasse mikrokiibi platvormi.[106] patogeenide multipleksseks tuvastamiseks (joonis 6d).Biosensorid tuvastavad tundlikult patogeenidest eraldatud subnanomolaarsed nukleiinhapped.
Tüüpiline signaali tuvastamise meetod.Cas13a hüperlokaliseeritud tuvastamise kontseptsioon (kohandatud [97]).b Grafeen nanobiosensor FET kombinatsioonis Lyme GroES scFv-ga (kohandatud [98]).c Kolorimeetrilised näidustused toidu kaudu levivate patogeenide multipleksseks tuvastamiseks tsentrifugaalses mikrofluidkiibis: proovid nr 1 ja nr 3 sihtpatogeenidega ning nr 2, nr 4 ja nr 5 proovid ilma sihtpatogeenideta (kohandatud [103]) .d Biosensor, mis põhineb magnettunneli ristmikul, mis sisaldab platvormi, sisseehitatud blokeerivat võimendit, juhtseadet ja signaali genereerimiseks/omandamiseks mõeldud toiteallikat (kohandatud [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikoon, PMMA polümetüülmetakrülaat
Vaatamata ülaltoodud tuvastamismeetodite suurepärastele omadustele on neil siiski puudusi.Neid meetodeid võrreldakse (tabel 1), sealhulgas mõned rakendused koos üksikasjadega (plussid ja miinused).
Mikrofluidika, mikroelektromehaaniliste süsteemide, nanotehnoloogia ja materjaliteaduse arenguga edeneb mikrofluidkiipide kasutamine nakkushaiguste tuvastamiseks pidevalt [55,96,107,108].Miniatuursete seadmete ja vedelike täpne manipuleerimine aitab kaasa diagnostilise täpsuse ja kulutasuvuse saavutamisele.Seetõttu on edasiseks arendamiseks tehtud jõupingutusi kiipide optimeerimiseks ja uuendamiseks, mille tulemuseks on erinevad erineva struktuuri ja funktsioonidega mikrofluidkiibid.Siin tutvustame lühidalt mitmeid levinud mikrofluidplatvormide tüüpe ja võrdleme nende omadusi (plusse ja miinuseid).Lisaks keskendub enamik allpool loetletud näidetest peamiselt SARS-CoV-2 vastu võitlemisele.
LOCC-d on kõige levinumad miniatuursed komplekssed analüütilised süsteemid ja nende toimingud on väga miniatuursed, integreeritud, automatiseeritud ja paralleelsed alates proovide süstimisest ja ettevalmistamisest, voolu juhtimisest ja vedeliku tuvastamisest [109, 110].Vedelikega manipuleeritakse hoolikalt kavandatud geomeetria ja paljude füüsikaliste efektide, nagu rõhugradiendid, kapillaaride toime, elektrodünaamika, magnetväljad ja akustilised lained, koosmõju [111].LOCC-l on suurepärased eelised suure läbilaskevõimega sõelumisel ja mitmekordsel tuvastamisel, kiire analüüsikiirus, väike valimi suurus, madal energiatarve ning kõrge haldus- ja töötõhusus;LOCC-seadmed on aga väga delikaatsed ning nende tootmine, pakendamine ja liidestamine.Multipleksimine ja taaskasutamine seisavad aga silmitsi tohutute raskustega [96].Võrreldes teiste platvormidega on LOCC-l ainulaadsed eelised rakenduste maksimaalse mitmekesisuse ja parima tehnoloogia ühilduvuse osas, kuid ilmselged on ka selle puudused, nimelt suur keerukus ja halb korratavus.Sõltuvus välistest pumpadest, mis on sageli mahukad ja kallid, piirab veelgi nende kasutamist POCT-s.
COVID-19 puhangu ajal pälvis LOCC palju tähelepanu.Samal ajal on mitmeid uusi kiipe, mis ühendavad mitu tehnoloogiat.Näiteks nutitelefone kasutatakse nüüd laialdaselt kaasaskantavate analüüsiseadmetena ja neil on suur potentsiaal LOCC integreerimiseks.Sun et al.[21] valmistas mikrofluidkiibi, mis võimaldab multipleksida viie patogeeni, sealhulgas SARS-CoV-2 spetsiifilisi nukleiinhappejärjestusi, kasutades LAMP-i, ja analüüsis neid nutitelefoni abil 1 tunni jooksul pärast reaktsiooni lõppu.Teise näitena on Sundah et al.[112] lõi molekulaarse lüliti [katalüütiline võimendamine molekulaarse ülemineku oleku lülitiga (CATCH)] SARS-CoV-2 RNA sihtmärkide otseseks ja tundlikuks tuvastamiseks nutitelefonide abil. CATCH ühildub kaasaskantava LOCC-ga ja saavutab suurepärase jõudluse (ligikaudu 8 RNA koopiat/μl; < 1 h toatemperatuuril) [112]. CATCH ühildub kaasaskantava LOCC-ga ja saavutab suurepärase jõudluse (ligikaudu 8 RNA koopiat/μl; < 1 h toatemperatuuril) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копна 1 тумре; </1мчий РНКрипечива CATCH ühildub kaasaskantava LOCC-ga ja tagab suurepärase läbilaskevõime (ligikaudu 8 RNA koopiat/µl; < 1 h toatemperatuuril) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时] CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时] CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкри; трай 1 копий РНК/мкри; < совместим с портативными LOCC CATCH ühildub kaasaskantavate LOCC-dega ja sellel on suurepärane jõudlus (ligikaudu 8 RNA koopiat/µl; < 1 tund toatemperatuuril) [112].Lisaks kasutavad molekulaardiagnostika LOCC-seadmed ka mõningaid liikumapanevaid jõude, nagu vaakum, venitus ja elektriväljad.Kang et al.[113] demonstreeris reaalajas ülikiiret nanoplasma-kiibil PCR-i COVID-19 kiireks ja kvantitatiivseks diagnoosimiseks välitingimustes, kasutades vaakumplasmoonset vedelat PCR-kiipi.Li et al.[114] töötas seejärel välja venitusajamiga mikrofluidkiibi, mis võimaldas COVID-19 diagnoosida.Platvorm kasutab RT-LAMP võimendussüsteemi, et teha kindlaks, kas proov on kvalitatiivselt positiivne või negatiivne.Seejärel Ramachandran et al.[115] saavutasid sobivad elektrivälja gradiendid, kasutades isotachoforeesi (ITP), selektiivset ioonide fokuseerimise tehnikat, mida rakendatakse mikrofluidikas.ITP abil saab toores ninaneelu tampooniproovidest siht-RNA-d automaatselt puhastada.Seejärel Ramachandran et al.[115] Selle ITP puhastamise kombineerimisel ITP-ga täiustatud LAMP- ja CRISPR-testidega tuvastati SARS-CoV-2 inimese ninaneelu tampooniproovides ja kliinilistes proovides umbes 35 minutiga.Lisaks tekivad pidevalt uued ideed.Jadhav et al.[116] pakkus välja diagnostilise skeemi, mis põhineb pinnaga täiustatud Ramani spektroskoopial koos mikrofluidiseadmega, mis sisaldab kas vertikaalselt orienteeritud kulla/hõbedaga kaetud süsinik-nanotorusid või ühekordselt kasutatavaid elektrokeeruga mikro-/nanotorusid.Membraaniga funktsionaliseeritud sisseehitatud filtri mikrokanalid on ühekordsed.Seade adsorbeerib viiruseid erinevatest kehavedelikest/eritisest nagu sülg, ninaneelus ja pisarad.Seega on viiruse tiiter rikkalik ja viirust saab Ramani signatuuri järgi täpselt tuvastada.
LOAD on tsentrifugaalne mikrofluidiplatvorm, milles kõiki protsesse juhib sagedusprotokoll, mis pöörab mikrostruktureeritud substraati [110].LOAD-seadet iseloomustab tsentrifugaaljõu kasutamine olulise liikumapaneva jõuna.Vedelikud alluvad ka kapillaar-, Euleri ja Coriolise jõududele.Tsentrifuugiseadme abil tehakse analüüse pidevas vedelikurežiimis radiaalsest sissepoole suunatud asendist väljapoole, välistades vajaduse täiendavate väliste torude, pumpade, täiturmehhanismide ja aktiivsete ventiilide järele.Lühidalt öeldes lihtsustab üks juhtimismeetod toimimist.Samas mikrofluidikanalis koormuskeskmest samal kaugusel olevale vedelikule mõjuvad jõud on võrdsed, mis võimaldab korrata kanali struktuuri.Seega on LOAD-seadmete projekteerimine ja tootmine lihtsam ja ökonoomsem kui tavalised LOCC-seadmed, samas kui reaktsioonid on suures osas sõltumatud ja paralleelsed;kuid tsentrifugaalseadmete suure mehaanilise tugevuse tõttu on saadaolev laastumaterjal piiratud ja väikesed mahud on keerulised.auto juurde.Samal ajal on enamik LOAD-seadmeid mõeldud ainult ühekordseks kasutamiseks, mis on kulukas suuremahuliseks tuvastamiseks [96, 117, 118, 119].
Viimastel aastakümnetel on üheks lootustandvamaks mikrofluidiseadmeks peetud LOAD pälvinud teadlaste ja tootjate märkimisväärset tähelepanu.Seega on LOAD saavutanud laialdase tunnustuse ja seda on kasutatud nakkushaiguste patogeenide [120, 121, 122, 123, 124] molekulaardiagnostikas, eriti COVID-19 puhangu ajal.Näiteks 2020. aasta lõpus avaldasid Ji jt.[60] demonstreerisid otsest RT-qPCR analüüsi SARS-CoV-2 ning A- ja B-gripi infektsioonide kiireks ja automatiseeritud paralleelseks tuvastamiseks kurgu tampooniproovides.Siis Xiong et al.[74] esitles LAMP-ga integreeritud diskoidset mikrofluidiplatvormi seitsme inimese hingamisteede koronaviiruse, sealhulgas SARS-CoV-2 kiireks, täpseks ja samaaegseks tuvastamiseks 40 minuti jooksul.2021. aasta alguses tegid de Oliveira jt.[73] demonstreeris COVID-19 RT-LAMP molekulaardiagnostikaks polüstüreenist tooneri tsentrifugaalset mikrofluidkiipi, mida juhiti käsitsi sõrmeotsa rotaatoriga.Seejärel Dignan et al.[39] esitles automatiseeritud kaasaskantavat tsentrifuugi mikroseadet SARS-CoV-2 RNA puhastamiseks otse põse tampoonilõikudest.Medved et al.[53] pakkus välja sisseehitatud SARS-CoV-2 aerosooli proovivõtusüsteemi väikese mahuga pöörleva mikrofluidse fluorestseeruva kiibiga, mille tuvastamispiir on 10 koopiat/μL ja minimaalne tsüklilävi 15 minutit.Suarez et al.[75] teatas hiljuti integreeritud modulaarse tsentrifugaalse mikrofluidiplatvormi väljatöötamisest SARS-CoV-2 RNA otseseks tuvastamiseks kuumaga inaktiveeritud ninaneelu tampooniproovides, kasutades LAMP-i.Need näited näitavad LOADi suurt kasu ja lubadust COVID-19 molekulaardiagnostikas.
1945. aastal esitlesid Muller ja Clegg [125] esmakordselt mikrofluidikanaleid paberil, kasutades filterpaberit ja parafiini.2007. aastal lõi Whitesidesi rühm [126] esimese funktsionaalse paberiplatvormi valkude ja glükoosi testimiseks.Paberist on saanud ideaalne substraat mikrofluidika jaoks.Paberil on omased omadused, nagu hüdrofiilsus ja poorne struktuur, suurepärane biosobivus, kerge kaal, paindlikkus, voltitavus, madal hind, kasutuslihtsus ja mugavus.Klassikalised µPAD-id koosnevad hüdrofiilsetest/hüdrofoobsetest struktuuridest, mis on ehitatud pabersubstraatidele.Sõltuvalt kolmemõõtmelisest struktuurist võib μPAD-id jagada kahemõõtmelisteks (2D) ja kolmemõõtmelisteks (3D) μPAD-deks.2D µPAD-id toodetakse hüdrofoobsete piiride moodustamise teel, et moodustada mikrofluidikanaleid, samas kui 3D µPAD-id valmistatakse tavaliselt 2D-mikrofluidse paberi kihtide virnadest, mõnikord paberi voltimise, libisemistehnikate, avatud kanalite ja 3D-printimise teel [96].μPAD-i vesi- või bioloogilisi vedelikke juhitakse peamiselt kapillaarjõu abil ilma välise toiteallikata, hõlbustades reaktiivide eelsäilitamist, proovide käsitlemist ja multipleksi tuvastamist.Täpset voolujuhtimist ja multipleksi tuvastamist takistab aga ebapiisav tuvastamise kiirus, tundlikkus ja korduvkasutatavus [96, 127, 128, 129, 130].
Ebatavalise mikrofluidiplatvormina on μPAD laialdaselt propageeritud ja arendatud nakkushaiguste, nagu HCV, HIV ja SARS-CoV-2 molekulaardiagnostika jaoks [131, 132].HCV selektiivseks ja tundlikuks tuvastamiseks kasutasid Tengam et al.[133] töötasid välja uudse fluorestsentspaberil põhineva biosensori, kasutades väga spetsiifilist pürrolidinüülpeptiidil põhinevat nukleiinhappesondi.Nukleiinhapped immobiliseeritakse kovalentselt osaliselt oksüdeeritud tselluloospaberile aminorühmade ja aldehüüdrühmade vahelise redutseeriva alküülimise teel ning tuvastamine põhineb fluorestsentsil.Neid signaale saab lugeda spetsiaalselt valmistatud vidinaga koos kaasaskantava fluorestsentskaameraga koos mobiiltelefoni kaameraga.Seejärel Lu et al.[134] kavandas nikli/kulla nanoosakeste/süsinik-nanotorude/polüvinüülalkoholi metallorgaanilise raamistiku komposiitidel põhineva paberipõhise painduva elektroodi HIV-i sihtmärgi tuvastamiseks DNA hübridisatsiooni teel, kasutades DNA redoks-indikaatorina metüleensinist.Hiljuti on Chowdury et al.[135] esitas hüpoteetilise platvormi konstruktsiooni µPAD-testimiseks hoolduspunktis, kasutades toorest patsiendi sülge koos LAMP-iga ja kaasaskantavat pilditehnoloogiat COVID-19 analüüdi tuvastamiseks.
Külgvoolu testid juhivad vedelikke kapillaarjõudude abil ja kontrollivad vedeliku liikumist poorsete või mikrostruktureeritud substraatide märguvuse ja omaduste järgi.Külgvoolu seadmed koosnevad proovist, konjugaadist, inkubaatorist ja detektorist ning absorbeerivatest padjadest.LFA-s olevad nukleiinhappemolekulid tunnevad ära spetsiifilised sideained, mis on eelnevalt säilitatud seondumiskohas, ja seonduvad kompleksidena.Kui vedelik läbib inkubeerimis- ja tuvastamisplaate, püüavad kompleksid kinni püüdmismolekulid, mis asuvad test- ja kontrolljoontel, näidates tulemusi, mida saab otse palja silmaga lugeda.Tavaliselt saab LFA lõpule viia 2–15 minutiga, mis on kiirem kui traditsiooniline avastamine.Tänu spetsiaalsele mehhanismile nõuab LFA vähe operatsioone ega vaja lisavarustust, mistõttu on see väga kasutajasõbralik.Seda on lihtne valmistada ja miniatuurstada ning paberipõhiste substraatide maksumus on madalam.Kuid seda kasutatakse ainult kvalitatiivseks analüüsiks ja kvantitatiivne tuvastamine on väga keeruline ning multipleksimisvõime ja läbilaskevõime on väga piiratud ning korraga saab tuvastada ainult ühe piisava nukleiinhappe [96,110,127].
Kuigi enamik LFA rakendusi on keskendunud immuunanalüüsidele, on LFA kasutamine molekulaardiagnostikas ka mikrofluidkiipides tõhus ja populaarne [136].B-hepatiidi viiruse puhul HIV ja SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] pakkus välja nanoosakeste LFA-platvormi ja demonstreeris selle miniatuurse ja kaasaskantava platvormi mitmekülgsust mitme sihtmärgi, näiteks HBV nukleiinhappe tundliku ja kvantitatiivse tuvastamise kaudu.Lisaks Fu et al.[138] demonstreerisid uudset LFA-d, mis põhinevad pinnaga täiustatud Ramani spektroskoopial HIV-1 DNA kvantitatiivseks analüüsiks madalatel kontsentratsioonidel.SARS-CoV-2 kiireks ja tundlikuks tuvastamiseks kasutasid Liu et al.[85] töötas välja mikrofluidiga integreeritud RPA külgvoolu analüüsi, ühendades RT-RPA ja universaalse külgvoolu tuvastamise süsteemi üheks mikrofluidiliseks süsteemiks.
Erinevate mikrofluidiliste platvormide rakendus varieerub sõltuvalt konkreetsetest uuringutest, kasutades platvormide võimalusi ja eeliseid täielikult ära.Soodsate ventiilide, pumpade ja kanalitega LOCC on kõige laiahaardelisem platvorm rakenduste mitmekesisuse ja koostalitlusvõime jaoks, millel on suurim arenguruum.Seetõttu loodame ja soovitame LOCC-s esimese katsena läbi viia uusimad uuringud ja optimeerida tingimusi.Lisaks loodetakse tõhusamate ja täpsemate meetodite avastamist ja süsteemis kasutamist.LOAD paistab silma olemasolevate LOCC-seadmete vedelike täpse juhtimisega ja demonstreerib ainulaadseid eeliseid üksikute ajamite puhul tsentrifugaaljõu abil, ilma et oleks vaja väliseid ajameid, samas kui paralleelseid reaktsioone saab eraldi ja sünkroonida.Seega muutub LOAD tulevikus peamiseks mikrofluidiliseks platvormiks, kus on vähem käsitsi toiminguid ning küpsemad ja automatiseeritud tehnoloogiad.µPAD platvorm ühendab LOCC ja paberipõhiste materjalide eelised madala hinnaga ühekordseks diagnostikaks.Seetõttu peaks edasine areng keskenduma mugavatele ja väljakujunenud tehnoloogiatele.Lisaks sobib LFA hästi palja silma tuvastamiseks, lubades vähendada proovide tarbimist ja kiirendada tuvastamist.Üksikasjalik platvormide võrdlus on näidatud tabelis 2.
Digitaalsed analüüsid jagavad proovi paljudeks mikroreaktoriteks, millest igaüks sisaldab diskreetset arvu sihtmolekule [139, 140].Digitaalsed testid pakuvad olulisi eeliseid absoluutse kvantifitseerimise teostamiseks, tehes tuhandeid paralleelseid biokeemilisi katseid samaaegselt ja individuaalselt mikronimõõtkavas sektsioonides, mitte pidevas faasis.Võrreldes traditsiooniliste mikrofluidikatega võivad sektsioonireaktsioonid vähendada proovi mahtu, suurendada reaktsiooni efektiivsust ja neid saab hõlpsasti integreerida teiste analüütiliste meetoditega, ilma et oleks vaja kanaleid, pumpasid, ventiile ja kompaktseid konstruktsioone [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Lahuste, sealhulgas reaktiivide ja proovide (nt rakud, nukleiinhapped ja muud osakesed või molekulid) ühtlase ja täpse eraldamise saavutamiseks kasutatakse digitaalanalüüsides kahte järgmist meetodit: (1) tilk-emulsioonid, mis kasutavad ära vedeliku liidese ebastabiilsust;(2) massiivi jagamine toimub seadme geomeetriliste piirangute alusel.Esimese meetodi puhul saab mikrokanalites reagente ja proove sisaldavaid tilka luua passiivsete meetoditega, nagu kaasvool, ristvool, voolu fokuseerimine, etapiviisiline emulgeerimine, mikrokanalite emulgeerimine ja membraanid viskoossete nihkejõudude abil ja emulgeerimine koos kanalivahetusega.lokaliseerimine [143, 145, 146, 148, 149] või aktiivsete meetodite kasutamine [150, 151], mis toovad elektrilise, magnetilise, termilise ja mehaanilise juhtimise kaudu lisaenergiat.Viimase lähenemisviisi korral jagatakse mikrofluidikambrites parimat vedelikumahu ühtlust, hoides ruumilised struktuurid, nagu mikrosüvendid ja pinnamassiivid, sama suurusega [152, 153, 154].Eelkõige on tilgad peamised voolusektsioonid, mida saab genereerida ja manipuleerida ka digitaalsel mikrofluidikal (DMF) põhinevatel elektroodimassiividel.Dielektrikute elektriline märgumine on üks paremini uuritud DMF teooriaid, kuna dielektrikute elektriline niisutamine võimaldab täpselt manipuleerida üksikute tilkadega, kontrollides vedeliku kuju ja eri külgi läbivate asümmeetriliste elektriliste signaalide kuju [141, 144].Peamised toimingud tilkadega DMF-is hõlmavad sorteerimist, tükeldamist ja liitmist [151, 155, 156], mida saab rakendada erinevates analüüsivaldkondades, eriti molekulaarses tuvastamises [157, 158, 159].
Digitaalne nukleiinhapete tuvastamine on kolmanda põlvkonna molekulaardiagnostika tehnoloogia, mis järgib tavapärast PCR-i ja kvantitatiivset reaalajas PCR-i (qPCR), paralleelselt suure läbilaskevõimega sekveneerimise ja vedeliku biopsiaga.Viimase kahe aastakümne jooksul on digitaalsed nukleiinhapped kiiresti arenenud nakkushaiguste patogeenide molekulaardiagnostika valdkonnas [160, 161, 162].Digitaalse nukleiinhappe tuvastamise absoluutne kvantifitseerimine algab proovide ja reaktiivide pakkimisega üksikutesse sektsioonidesse, et tagada igal sihtjärjestusel sama tõenäosus igasse eraldi sektsiooni siseneda.Teoreetiliselt võib igale sektsioonile määrata mitu sihtjärjestust või ei pruugi olla sõltumatut mikroreaktsioonisüsteemi.Erinevate ülalkirjeldatud tuvastusmehhanismide abil saab palja silmaga või masinaga visualiseerida teatud läve ületavaid signaale genereerivaid mikroobsete sihtjärjestustega sektsioone ja märgistada need positiivseteks, samas kui teised sektsioonid, mis genereerivad alla läviväärtuse signaale, märgitakse positiivseteks. .negatiivsed, mis muudavad iga jaotise signaali tõeväärtuslikuks.Seega, arvutades loodud sektsioonide arvu ja positiivsete tulemuste määra pärast reaktsiooni, saab testitavate proovide originaalkoopiaid Poissoni jaotuse valemi abil sobitada, ilma et oleks vaja standardkõverat, mida on vaja tavapärasteks kvantitatiivseteks analüüsideks, näiteks kui qPCR.[163] Võrreldes traditsiooniliste molekulaardiagnostika meetoditega on digitaalsel nukleiinhapete tuvastamisel suurem automatiseerituse tase, suurem analüüsi kiirus ja tundlikkus, vähem reaktiive, vähem saastumist ning lihtsam disain ja tootmine.Nendel põhjustel on SARS-CoV-2 kriitilise puhangu ajal hästi uuritud digitaalsete analüüside, eriti tilgapõhiste meetodite kasutamist molekulaardiagnostikas, kombineerides amplifikatsiooni ja signaali lugemise tehnikaid.Näiteks Yin et al.[164] kombineerisid tilk-digitaalseid ja kiireid PCR-meetodeid SARS-CoV-2 ORF1ab, N ja RNaasi P geenide tuvastamiseks mikrofluidkiibis.Eelkõige suutis süsteem tuvastada positiivse signaali 115 sekundi jooksul, mis on kiirem kui tavaline PCR, mis näitab selle tõhusust hoolduspunktide tuvastamisel (joonis 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] ja Alteri et al.[167] rakendas ka tilk-digitaalset PCR-i (ddPCR), et tuvastada SARS-CoV-2 mikrofluidsüsteemis muljetavaldavate tulemustega.Avastamissageduse edasiseks parandamiseks on Shen et al.[168] saavutas ddPCR-põhise kiibi kujutise kõigest 15 sekundiga ilma kujutise ühendamise tehnikat kasutamata, kiirendades ddPCR-tehnoloogia protsessi laborist rakendusteni.Reaktsioonitingimuste ja kiire reageerimise lihtsustamiseks kasutatakse mitte ainult termilise amplifikatsiooni meetodeid, nagu PCR, vaid ka isotermilisi võimendusmeetodeid.Lu et al.[71] töötas tilkade analüüsiks välja SlipChipi, mis on võimeline genereerima ühes etapis suure tihedusega erineva suurusega tilkasid ja kvantifitseerima SARS-CoV-2 nukleiinhappeid digitaalse LAMP-i abil (joonis 7b).Kiiresti areneva tehnoloogiana võib CRISPR mängida olulist rolli ka digitaalsel nukleiinhapete tuvastamisel mugava kolorimeetrilise pildistamise abil, ilma et oleks vaja täiendavaid nukleiinhappeplekke.Ackerman et al.töötas välja kombinatoorse maatriksreaktsiooni nukleiinhapete multipleksseks hindamiseks.[158] tuvastas mikrosüvendi analüüsis 169 inimesega seotud viirust, sealhulgas SARS-CoV-2, tilkades, mis sisaldasid CRISPR-Cas13-põhiseid nukleiinhapete tuvastamise reagente (joonis 7c).Lisaks saab samas süsteemis kasutada isotermilist võimendust ja CRISPR-tehnoloogiat, et kombineerida mõlema eeliseid.Park jt.[169] Kaubanduslikus mikrofluidkiibis töötati välja CRISPR/Cas12a digitaalanalüüs ekstraheeritud ja kuumusega surmatud SARS-CoV-2 tuvastamiseks, mis põhineb üheastmelisel RT-RPA-l lühema ja kõrgema signaali-tausta tuvastamisega. aja suhe., laiem dünaamiline ulatus ja parem tundlikkus (joonis 7d).Mõned nende näidete kirjeldused on toodud tabelis 3.
Tüüpiline digitaalne platvorm nukleiinhapete tuvastamiseks.a Kiire digitaalne PCR töövoog koosneb neljast põhietapist: proovi ettevalmistamine, reaktsioonisegu jaotamine, amplifikatsiooniprotsess ja sihtmärgi kvantifitseerimine (kohandatud [164]).b Skeem, mis näitab SlipChipi tilkade analüüsi suure tihedusega tilkade moodustumiseks (kohandatud [71]).c CARMEN-Cas töövoo diagramm13 (kohandatud [158]).d Ülevaade täiustatud digitaalsest viirustuvastusest CRISPR/Cas-iga ühes potis (kohandatud [169]).W/O vesi-õlis, polüdimetüülsiloksaani PDMS, PCR polümeraasi ahelreaktsioon, DAQ andmete kogumine, PID proportsionaalne integraalderivaat, CARMENi kombinatoorne maatriksreaktsioon multipleksse nukleiinhappe hindamiseks, SARS-CoV-2, raske äge respiratoorne sündroom, koroonaviirus 2, RT Pöördtranskriptaasi rekombinaasi polümeraasi-RPA võimendamine, S/B signaal taustal